葫蘆科植物轉基因研究的轉化方法及研究進展(綜述)
期刊: Plant Biotechnol (Tokyo)
IF:1.133
時間:2020.7
單位: 日本植物細胞和分子生物學學會
黃瓜 ( Cucumis sativus L.) 和Cucurbita葫蘆科植物(甜瓜、南瓜和葫蘆)是世界上主要的蔬菜作物之一。轉基因方法有助於培育優良品種。儘管如此,到目前為止,使用這些物種轉化的研究報告非常有限。在本綜述中,我們描述了黃瓜和南瓜植物轉化的有效方案,並提到了遵循這些方案可能存在的缺陷和建議。此外,我們還討論了使用黃瓜和南瓜進行遺傳轉化研究的當前進展,包括基因組編輯。
關鍵詞:黃瓜,葫蘆科植物,基因組編輯,再生,轉化
引言:
黃瓜(Cucumis sativus L.)屬於葫蘆科,是日常生活中常用的蔬菜。2017年全球黃瓜產量為8380萬噸,其中中國佔77.4%。在日本,黃瓜也很受歡迎,2017年生產了56萬噸,使日本成為世界第十大黃瓜生產國。黃瓜植株遭受多種病害,例如霜黴病、白粉病、炭疽病和黃瓜花葉病毒,這些病害限制了作物的生產。然而,由於植株遺傳基礎淺薄,常規育種難以提高黃瓜對病原菌侵襲的耐受性(Plader et al. 2007)。南瓜(也叫南瓜和葫蘆;Cucurbita pepo、C. maxima和C. moschata)是葫蘆科的另一種重要蔬菜。葫蘆的全球產量在2017 年,南瓜品種達到 2740 萬噸(FAOSTAT),主要在中國和印度,分別佔全球所有南瓜的 29.1% 和 18.7%。可用於食品、動物飼料和觀賞用途。此外,它們還用作其他栽培葫蘆科植物的砧木,包括西瓜、黃瓜和甜瓜,以增強對低溫和土傳病害的耐受性(戴維斯等人,2008 年)。此外,與其他植物科相比,它們具有從土壤中吸收更多有機生物質和持久性有機汙染物的獨特能力(Otani 等人,2007 年)。
已獲得黃瓜和葫蘆科植物的下一代測序 (NSG) 數據(Huang 等人,2009 年;Montero-Pau 等人,2018 年;Sun 等人,2017 年)。對這些數據的分析發現新基因和調控序列並確認它們的位置,並提供大量分子標記集合。全基因組表達研究使育種者了解複雜性狀的分子基礎,例如成熟過程、韌皮部運輸、抗病性、耐寒性和果實品質。黃瓜和葫蘆科植物的轉化方法將有助於基礎科學和分子育種。
1986 年首次報導了用髮根農桿菌成功轉化黃瓜植物(Trulson 等人,1986 年)。1992 年還報導了一種粒子轟擊轉化方法(Chee 和 Slightom 1992)。近年來,根癌農桿菌介導的轉化主要用於黃瓜。已經產生了轉基因黃瓜品系,用於分析與病原體抗性、脅迫耐受性等(Narusaka 等,2013;Wang 等,2014;Zhang 等,2014)。特裡科利等人(1995)首次報導了表現出多種病毒抗性的轉基因黃曲頸南瓜品系 ( C. pepo )的開發,但其方法的細節仍然是個謎。關於C. pepo轉化的第二篇文章發表於 2008 年,報告轉化效率為 0.7%。2011年實現了C. moschata的成功轉化(Nanasato et al. 2011),轉化效率為2.7%。通過對受傷的外植體應用真空滲透以增強農桿菌進入更深層的細胞,轉化效率可以提高到 9.2% (Nanasato 等人,2013b))。我們使用相同的方法成功地轉化了C. pepo和C. maxima。
在這裡,我們為對黃瓜和/或南瓜的組織培養和轉化感興趣但從未使用過此類方法的研究人員提供一些信息。給出的信息基於我們的黃瓜和南瓜轉化方案(Nanasato et al. 2011 , 2013a , b ; Nanasato and Tabei 2012 , 2015 ; Tabei and Nanasato 2012)(圖1, 表格1)。即使遵循特定程序,組織培養和轉化也經常失敗。我們確定記錄實驗中可能存在的缺陷,並提供避免它們的建議。最後,我們討論了黃瓜和南瓜遺傳轉化研究的當前進展,包括基因組編輯。
圖 1. 黃瓜(cv. Shinhokusei No.1)和南瓜(cv. Heiankogiku)植物通過子葉外植體的直接莖器官發生轉化的步驟。芽誘導(SI)培養基、接種(IN)培養基、選擇(SE)培養基和伸長(EL)培養基的組成示於表格1. 將農桿菌(OD 600 )的濃度調整為 0.5 。
表 1. 用於黃瓜和南瓜轉化的培養基組成
所有培養基的 pH 值 表格1在加入瓊脂之前用 NaOH 調節。§植物激素在無菌條件下加入已冷卻至約 55°C 的滅菌培養基。ABA,脫落酸;BA,6-苄基腺嘌呤;GA 3 , 赤黴素 A 3 ; MES, 2-( N-嗎啉代)乙磺酸;MS,植物生長培養基
外植體的製備以實現高效再生
各種組織,如真葉、下胚軸、莖節和子葉,已被用作黃瓜植株再生和轉化的外植體(Nishibayashi et al. 1996 ; Miao et al. 2009 ; Trulson et al. 1986 ; Ziv and加達西 1986 年)。1994 年,Colijn-Hootmans 等人報導了使用幼苗近端(預培養 1 天)的黃瓜植株可以植株有效再生,(在文獻中經常看到使用子葉的近端區域作為外植體。圖 2A、B) ( Hu et al. 2017 ; Selvaraj et al. 2006 , 2010 ; Vengadesan et al. 2005 )。預培養 1 天后,使用鑷子將子葉與種子分離。子葉的遠端部分被去除,因為它們沒有再生能力。南瓜外植體的製備過程與黃瓜相似:從 4天齡的幼苗中切下未成熟的子葉。然而,特別是在南瓜的情況下,應注意不要通過折斷下胚軸來去除莖尖周圍的子葉節。圖 2C),因為只有這一部分保留了再生能力,正如之前報導的那樣 ( Ananthakrishnan et al. 2003 ; Kathiravan et al. 2006 ; Lee et al. 2003 ; Zhang et al. 2008 )。為了產生更多的轉基因材料,我們使用子葉的近端部分,縱向切成兩塊,作為外植體(圖 2B、D)。然而,一些植物材料使用子葉的整個近端部分作為外植體。
圖 2.外植體的製備。使用手術刀和鑷子去除種皮。將去皮的種子在 1% (w/v) 次氯酸鈉水溶液中滅菌 10 分鐘,並輔以一滴吐溫 20,不時攪拌,然後用無菌蒸餾水衝洗 5 次。滅菌後的種子在相應的芽誘導培養基上28℃避光發芽1天。(A) 發芽的黃瓜種子,在黑暗中 28°C 孵育 1 天。比例尺=5 毫米。(B) 分離的黃瓜子葉。用箭頭標記的近端區域用作外植體。比例尺=5 毫米。(C) 南瓜子葉的近端區域。黃色箭頭表示子葉和下胚軸的交界處。黑色箭頭表示芽尖。比例尺=1 毫米。(D) 分離的南瓜子葉。就像黃瓜一樣,近端區域用作外植體。比例尺=5 毫米。所有圖片均改編自Nanasato and Tabei (2012)和Tabei and Nanasato (2012),由日本京都 Kagaku-Dojin 提供。
用於植株再生的植物激素
儘管已經在黃瓜植物中報導了通過體細胞胚胎發生的間接器官發生途徑(Burza et al. 2006 ; Chee 1990 ; Raharjo and Punja 1994),但直接器官再生時間方面優於間接器官發生。Murashige-Skoog (MS) 培養基(Murashige 和 Skoog 1962)含有 1–2 mg l -1 6-苄基腺嘌呤 (BA) 和 0.5–1.0 mg l -1脫落酸 (ABA) 已被證明可導致黃瓜的有效再生植物 ( Tabei et al. 1998 ; Zhang et al. 2017 ),而在南瓜中,添加 ABA 會導致壞死 ( Nanasato et al. 2011 ))。對於南瓜品種,使用含有 1 mg l -1 BA 的MS 培養基進行再生(Kathiravan 等人,2006 年;Nanasato 等人,2013b;Zhang 等人,2008 年)。
據報導,在黃瓜植物中使用粒子轟擊進行基因轉移(Kodama 等人,1993 年;Schulze 等人,1995 年)。目前,農桿菌介導的轉化方法更常用於基因轉移;菌株 EHA105 和 LBA4404 可用於黃瓜和南瓜的轉化。在我們的案例中,含有 pBI121 衍生的二元載體的 EHA 105 用 Luria-Bertani (LB) 培養基培養,該培養基含有 10 mM 2-( N-嗎啉代)乙磺酸 (MES)、50 mg l -1卡那黴素、25 mg l −1氯黴素、25 mg l −1利福平和 20 µM 乙醯丁香酮,pH 5.2,28°C 直至 (OD 600) 達到 0.4–0.8。將細菌細胞沉澱並重新懸浮在接種培養基 (IN) 中。
農桿菌感染期間進行的物理處理
農桿菌感染期間的物理處理,如真空浸潤和傷口處理是黃瓜和南瓜成功轉化的最重要因素,圖 3A-C)。這些處理有助於提高農桿菌的接種效率,這些細胞具有器官發生的潛力(Nanasato 等人,2013b)。真空滲透的有效性已在其他研究小組的報告中得到證實(Hu et al. 2017 ; Zhang et al. 2017)。晶須(是在農桿菌侵染植株外植體時配置的輔助懸浮液)是具有非常高抗張強度的白色針狀晶體,可用於纏繞南瓜外植體(圖 3D、E) ( Nanasato et al. 2011 , 2013b )。此外,在用共培養基時在潤溼的濾紙上共培養外植體可以顯著提高轉化效率。圖 3F)。
圖 3.農桿菌感染的特殊處理。(A) 渦旋裝置和 50 ml 管,帶有 1% 晶須懸浮液。(B) 連接到真空泵的乾燥器。(C) 50 毫升管,白色箭頭表示用於氣體交換的通風孔。(D) 在傷口處理後通過在農桿菌感染前將外植體與 50 毫升管中的 20 毫升 1% (w/v) 晶須懸浮液渦旋 30 分鐘 (E)比例尺=2 毫米。(F) 黃瓜外植體在三片疊層濾紙上共培養,在 25°C 下,在黑暗中用 5.5 毫升接種培養基潤溼 3 天。比例尺=1 釐米。圖片 A-C 和 F 改編自Nanasato and Tabei (2012)和Tabei and Nanasato (2012),由日本京都 Kagaku-Dojin 提供。
圖 3.農桿菌感染的特殊處理。(A) 渦旋裝置和 50 ml 管,帶有 1% 晶須懸浮液。(B) 連接到真空泵的乾燥器。(C) 50 毫升管,白色箭頭表示用於氣體交換的通風孔。(D) 在傷口處理後通過在農桿菌感染前將外植體與 50 毫升管中的 20 毫升 1% (w/v) 晶須懸浮液渦旋 30 分鐘 (E)比例尺=2 毫米。(F) 黃瓜外植體在三片疊層濾紙上共培養,在 25°C 下,在黑暗中用 5.5 毫升接種培養基潤溼 3 天。比例尺=1 釐米。圖片 A-C 和 F 改編自Nanasato and Tabei (2012)和Tabei and Nanasato (2012),由日本京都 Kagaku-Dojin 提供。
非嵌合轉基因品系的選擇和生根
新黴素磷酸轉移酶 II ( NPTII ) 基因和卡那黴素的組合經常用於選擇轉化體。假陽性芽的再生幾乎是不可避免的,即使在嚴格的選擇條件下(圖 4A、D)。因此,使用綠色螢光蛋白 (GFP) 等標記也是獲得黃瓜和南瓜轉化體的關鍵。此外,通過直接器官發生發育的轉基因芽通常是嵌合的。嵌合個體由轉化細胞和非轉化細胞的混合物組成。視覺標記的使用對於區分嵌合體是有效的(圖 4B、C、E、F)。嵌合個體的根伸長時在含有抗生素的培養基中經常受到抑制。在選擇培養基中進行多輪腋芽誘導是從嵌合個體得到陽性植株的有效方法。
圖 4. 表達 GFP 的轉基因南瓜系。在可見光 (A) 和 GFP 螢光 (D) 激發光下的轉基因芽。在由 D 中的白色箭頭指示的固體轉基因枝條中觀察到強烈的 GFP 螢光,而在非轉基因枝條中觀察到紅色的自發螢光,由白色箭頭指示。在可見光 (B, C) 和 GFP 螢光 (E, F) 激發光下的扇形嵌合個體。E 和 F 中的白色箭頭表示表現出 GFP 螢光的轉基因細胞,E 和 F 中的白色箭頭表示非轉基因細胞。比例尺=5 毫米。
一些研究論文記錄了在生長培養基中添加低濃度的生長素,例如吲哚-3-丁酸 (IBA) 和 1-萘乙酸 (NAA) 以促進生根(Sarmento 等人,1992 年;Vasudevan 等人) . 2007 ; Zhang et al. 2008 )。在許多情況下,似乎沒有必要添加生長素來促進生根。在劇烈根枝條生長四到五個節點(約10釐米的高度)後,如先前所描述的枝條應移植到土壤(Nanasato和塔北2012,2015年;塔北和Nanasato 2012)。
基因組編輯技術在黃瓜和南瓜中的應用
自 2012 年 CRISPR/Cas9 技術公布(Jinek et al. 2012)以來,基因組編輯技術在植物功能基因組學研究和作物改良方面得到了迅速普及。迄今為止,兩個研究小組已經報導了使用 CRISPR/Cas9 系統在黃瓜植物中成功進行基因組編輯(Hu et al. 2017 ; Sherman et al. 2016)。兩組都通過雜交成功地產生了無轉基因的無效分離系。CRISPR/Cas9 系統還用於對C. moschata 中編碼 NADPH 氧化酶的基因進行功能分析( Huang et al. 2019 )。
結論
由於基因組信息的發展,對黃瓜和南瓜的研究得到了改進。黃瓜是葫蘆科模式植物的潛在候選者之一,將通過分子分析提供新的科學知識。此外,基因組編輯技術可能有助於黃瓜和南瓜的快速育種。轉化技術將在基礎科學和分子育種的進步中發揮越來越重要的作用。在這篇綜述中,我們根據我們之前發表的報告描述了黃瓜和南瓜植物的轉化方法。我們強調再生植物激素的濃度和土壤桿菌的條件感染應根據處理的植物品種進行調整。我們希望這篇綜述能夠為葫蘆科植物研究和分子育種的發展做出貢獻。