生物探索
編者按
人類有23對46條染色體，染色體的數量、結構相對恆定。由於染色體平衡易位僅有位置的改變，沒有可見的染色體或基因的增減，所以平衡易位攜帶者在生活中表型與普通人沒有區別。然而，染色體平衡易位攜帶者自然妊娠風險非常大，所以對於這類攜帶者，推薦通過人類輔助生殖技術進行生育，可避免生育風險。
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什麼是平衡易位
兩條不同源的染色體各發生斷裂後，互相變位重接而形成兩條結構上重排的染色體稱相互易位。這種易位大多數都保留了原有基因總數，對基因作用和個體發育一般無嚴重影響，故稱平衡易位。平衡易位是人類中最多的一類染色體結構畸變，在新生嬰兒中的發生率約為1/500～1/625[1, 2]。
羅氏易位是一種特殊的染色體重排類型，是指兩個近端著絲粒染色體在著絲粒或其附近斷裂後，短臂丟失，染色體長臂融合成為一條染色體，結果染色體數目減少，長臂數不變，但短臂數減少兩條的現象。羅氏易位主要發生在5條近端著絲粒染色體（13、14、15、21和22號染色體）上。人群發生率約為1/1000[3, 4]。
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平衡易位的風險
人類有23對46條染色體，染色體的數量、結構相對恆定。
由於染色體平衡易位僅有位置的改變，沒有可見的染色體或基因的增減，所以，平衡易位攜帶者在生活中表型與普通人沒有區別。然而，平衡易位的攜帶者與正常人婚後生育的子女中，卻有可能得到一條衍生的異常染色體，繼而導致某一易位節段的增多（部分三體型）或減少（部分單體型），由此引起的遺傳物質減少或增加就會破壞遺傳物質的平衡，最終導致胎兒畸形或自然流產。
具體來說，在平衡易位染色體分離形成配子的過程中，會形成一種叫作四射體的結構，考慮到分離規律以及交換重組的情況，這種四射體最終可能產生18種配子，這就導致最終產生的胚胎中，只有一種為完全正常，一種為表型正常的染色體平衡易位攜帶者，其餘16種均為異常胚胎。因此，染色相互易位攜帶者獲得完全正常胚胎的機率只有1/18[5]。
平衡易位攜帶者配子類型示意圖（以2號染色體與5號染色體發生易位為例）：
註：字母A、B、C和D代表染色體末端（端粒）
染色體平衡易位攜帶者自然妊娠風險非常大，主要以早孕期自然流產為主[6]，所以對於染色體平衡易位攜帶者推薦通過人類輔助生殖技術進行生育，挑選正常的胚胎植入，從而避免生育風險。
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檢測難點
目前的胚胎植入前染色體篩查多用於篩查由於易位產生的種種遺傳物質不平衡的胚胎，如何進一步將易位攜帶者和完全正常胚胎區分開，還存在一些問題：
1)需求/倫理：攜帶者表型多正常，平衡易位導致在臨床上正常生育的概率高於理論上的1/9[6, 7]，而且這種概率還會受到包含哪兩條染色體、斷裂點的位置及染色體易位攜帶者的性別等因素的影響[8]；
2)技術局限：平衡易位攜帶者本身未發生基因數量的缺失，一般的高通量測序和晶片技術難以區分易位型胚胎與完全正常胚胎[9]；
3)檢測難點：斷點精確位置的不易確定，為後期的胚胎區分帶來困難[10]。
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指南與共識
由於還沒有一個非常成熟的技術，目前對於易位型胚胎的區分國內外各協會均並沒有出臺指南規範或專家共識；並且由於易位型胚胎染色體的特殊性，目前單純依靠一種方法無法區分正常胚胎與易位型胚胎， 2010年ESHRE（European Society of Human Reproduction and Embryology，歐洲人類生殖及胚胎學會）發布的《基於螢光原位雜交的PGD最佳實踐指南》中指出，單純基於螢光原位雜交的PGD技術不足以分辨正常和攜帶平衡易位的胚胎[12]，2013年ACOG（American College of Obstetricians and Gynecologists，美國婦產科醫師學會）出臺的《染色體微陣列分析在產前診斷中的應用推薦》中指出，單純依靠CGH技術不能識別平衡易位[13]。
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技術介紹
尋找平衡易位斷點一直是行業內技術研發人員研究的熱點之一。早期尋找平衡易位染色體斷點的方法是通過原位雜交確定斷點位置所在的區域，再通過染色體步移測序尋找斷點，該方法費時費力，且成功率不高。2008年德國Ropers 研究小組採用特殊的流式細胞分選術分選平衡易位攜帶染色體，再對分選後的染色體進行高通量測序分析，從而找到斷點，但由於這一技術需要特殊的流式細胞儀和分選技術，且測序成本也較高，難以進行有效地推廣和臨床應用。2011年美國約翰霍普金斯大學和哈佛大學的兩個獨立小組均報導了運用區域捕獲技術結合高通量測序技術進行斷點查找的工作，這一方法雖然可以大大減少測序通量，但是需要設計特殊的捕獲晶片，費時費力，因而依舊難以應用於臨床。2012年新英格蘭醫學雜誌報導了美國哈佛大學的研究成果，即利用DNA環化建庫結合高通量測序技術進行斷點尋找。該方法無需進行中期分裂相的製備，可以利用DNA直接進行環化建庫，分析斷點信息，將斷點分析又向臨床推進了一步，然而，該方法需要用到特殊的建庫方法，測序要求的數據量較大(約需測序兩億八千萬reads)，在臨床應用上仍有一定困難[11]。
結合現有的相關文獻及報導，國內外對於易位攜帶型胚胎的檢測主要有以下幾種方法：環化建庫雙端測序法、顯微切割法、核型定位法以及單精子檢測/廢胚暴露斷點法等。
1.環化建庫雙端測序法
技術原理
雙端測序通過文庫中插入DNA片段成環，可獲取插入片段末端的信息，進行測序。通過雙端測序找到父母染色體平衡易位攜帶者斷裂點位置信息，根據斷裂點上下遊序列設計特異引物，用引物對胚胎單細胞全基因組擴增產物進行PCR驗證，判斷胚胎是否存在斷裂點。其實現基礎仍然是基於第二代測序技術的個體化設計，為易位型胚胎的鑑別提供新的方法[14]。
整體流程：
Mate pair建庫原理
臨床應用
中國人民解放軍總醫院在2015年到2016年期間對該技術的臨床應用可行性進行過驗證。該驗證實驗共納入了二對攜帶平衡易位的夫婦，最終有兩對夫婦通過該技術篩選出了完全正常的胚胎，且得到了後期核型分析的確認，最終生育了完全正常的後代。
技術特點
通過雙端測序精確定位染色體平衡易位的斷裂點，針對每個患者設計引物，結合高通量測序技術，在對胚胎進行整倍體性篩查後，進一步鑑別出正常胚胎及易位型胚胎。
技術局限性
測序要求的數據量較大，且對於序列高度重複區域無法檢測；另外在受精卵形成過程中胚胎的斷裂點位置可能發生微小改變，這也可能會導致斷點無法識別的情況發生。
2.顯微切割法
技術原理
利用染色體顯微切割技術獲得易位染色體斷點附近染色質，再利用高通量測序技術進行斷點的精確定位，高通量測序技術測序信息有利於對平衡易位染色體進行後續分析，如可以利用這些信息設計引物，對平衡易位攜帶者的胚胎進行PGD診斷，分辨完全正常胚胎和易位型胚胎，通過僅移植完全正常的胚胎阻斷平衡易位染色體在該家族中的傳遞。
整個實驗分為預實驗和正式實驗兩部分，預實驗部分通過對染色體平衡易位攜帶者的核型分析，顯微切割，高通量測序及一代測序獲得精確斷點位置，同時確定斷點上下遊SNP位點以用於連鎖分析。正式實驗部分對胚胎進行PGS檢測，首先排除能確定為非平衡易位的異常胚胎，再通過PCR方法，檢測剩餘胚胎樣本中是否存在斷點（結合使用SNP連鎖分析），最終篩選出完全正常的胚胎[10]。
預實驗
正式實驗
臨床應用
中信湘雅生殖與遺傳專科醫院作為該項技術的研發單位，早期在8例平衡易位攜帶者家庭中成功運用了該技術。第一例平衡易位攜帶者經顯微切割技術診斷完全正常的寶寶於2016年5月誕生，截止到2017年4月，該院已經幫助4例染色體易位患者生育了健康寶寶。
技術特點
1)通過顯微切割技術，可以通過比對，從兩個方向逼近斷點，準確度高且測序成本較低；
2)通過預實驗能獲得精確的斷裂點位置；
3)正式實驗部分周期較短（2-3周）；
4)通過斷點處PCR和 SNP連鎖分析雙重保險鑑別正常胚胎。
技術局限性
由於顯微切割是人工操作，該方法對操作人員的技術有一定要求。
3.核型定位法
技術原理
核型定位是一種基於SNP晶片的PGD技術，其原理是對比胚胎與父母和近親的DNA樣本，對平衡易位受試者進行全基因組SNP基因分型，然後利用連鎖分析構建攜帶者家系的全基因組單體型，分析非平衡易位胚胎單倍型確定斷裂點，通過定位胚胎是否攜帶易位染色體單體型以及易位斷裂點區域是否發生同源重組，來判斷胚胎的染色體狀態，實現正常型胚胎和易位型胚胎的精準區分[15]。
臨床應用
上海復旦大學附屬婦產科醫院上海集愛遺傳與不育診療中心對該技術進行了多個家系的臨床驗證，截至2017年3月，20個易位攜帶家庭中已有11個家庭成功生育了健康寶寶， 這些成功妊娠的孕婦均在孕中期接受了羊水穿刺，核型結果與PGH預測結果完全一致。
技術特點
1)有配套的分析軟體，對數據分析要求簡單；
2)SNP位點覆蓋全基因組23對染色體；
3)通過一次大規模樣本SNP晶片檢測即可獲得所需信息，無需再額外單獨設計
進行SNP連鎖分析；
4)可以分析羅氏易位和平衡易位；
5)檢測相對簡單，適用於常規臨床實驗室。
技術局限性
由於是固定的SNP探針，某些平衡易位斷點周圍可能無可用的SNP信息。
4.單精子測序/廢胚暴露斷點法
技術原理
如果在活檢時同時出現正常胚胎、易位型胚胎和染色體不平衡的胚胎，則首先針對這些異常胚胎做高通量測序，對這些胚胎中的異常拷貝數變異做進一步生物信息學分析確定斷點，構建斷點位置上下1Mb區域內的SNP單倍型，最終區分易位型和正常胚胎[9]；另外一項方案中，針對男方的平衡易位，採取的檢測方案在技術上主要是依賴單精子檢測技術，即利用易位重複型精子與易位缺失型精子的SNP信息進行比較，從而得出正常精子的單倍型，利用該信息，再結合女方相應位置上下純合SNP信息，最終區分攜帶者和正常胚胎[10]。
針對胚胎檢測方案
針對男性平衡易位攜帶者檢測方案
臨床應用
鄭州大學第一附屬醫院生殖醫學中心應用該技術，已經完成47對染色體易位夫婦的PGD阻斷， 12例成功妊娠的胎兒，經孕中期產前診斷，結果顯示為染色體完全正常，目前已出生健康嬰兒11例。
技術特點
1)準確性高：該技術中單細胞全基因組擴增技術擴增均一性好，等位基因脫扣率低，診斷準確性高；
2)易於操作：通過對染色體異常的精子或廢棄胚胎即可尋找染色體的斷裂位點，更易於操作；
3)應用範圍廣：對於所有的平衡易位類型及羅氏易位，都能通過該技術區分正常胚胎和易位型胚胎，應用範圍更廣。
技術局限性
對於胚胎種類有一定要求，在活檢時必須有染色體不平衡的胚胎存在以暴露斷點作為參考，才可以實現檢測。
5.Basemapping方案
方案內容
BaseMapping方案是易位型胚胎檢測的整體解決方案，包括顯微切割技術、核型定位技術、DNA環化建庫結合高通量測序技術。
技術原理
該技術裡涉及的DNA環化建庫測序技術主要是通過採集平衡易位攜帶者的細胞樣本，對樣本進行DNA片段化後環化，利用特有的技術獲得環化接點位置的DNA序列，通過高通量測序和數據分析明確平衡易位的斷點，並用長序列 PCR技術驗證斷點信息；此外，實驗人員還會根據斷裂點上下遊信息尋找合適的SNP位點信息，最終利用斷點信息結合SNP單倍體分析來區分正常胚胎和平衡易位攜帶胚胎，阻斷平衡易位的傳遞。
臨床應用
有一對患者夫婦，男34歲，女33歲。女方為平衡易位攜帶者，核型46,XY,t(5;22)(q33;q12)。在預實驗階段，研究人員通過DNA環化建庫結合高通量測序技術對女方細胞樣本進行斷點定位到核苷酸水平。隨後，對所獲得的7個胚胎進行PCR斷點驗證，並結合SNP連鎖分析確認，最終獲得1枚正常的胚胎進行植入。
技術優勢
1)斷點精確定位：選擇最合適的檢測技術，完成精確的斷點定位；
2)方案靈活選擇： BaseMapping提供的不同技術解決方案能夠滿足患者和醫療機構的不同需求。
3)樣本全面適用：該方案全面適用於平衡易位、羅氏易位以及倒位攜帶者的
PGD檢測。
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技術支持
蘇州貝康醫療器械有限公司（以下簡稱「貝康醫療」）是一家專注於高通量測序技術在輔助生殖領域的研發和臨床應用的高科技企業，同時也是本專題的技術支持。針對目前易位型胚胎檢測存在的問題，貝康醫療推出了BaseMapping方案，通過多種方法綜合運用，經濟、準確、高效的挑選出染色體正常的胚胎進行移植，以提高試管嬰兒的成功率，助力中國的出生缺陷水平降低。
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