實驗要注意:離心管內肯定不含有寡核苷酸引物

2020-12-10 娛樂小彬彬

ii.設置3個陰性對照。第1個陰性對照中加入合成第- -鏈cDNA反應所需的所有試劑，但不加模板RNA;第2個陰性對照加入除了反轉錄酶外的所有試劑：第3個陰性對照中加入除引物外的所有試劑。

這些對照進行所有的後續步驟。設置這些對照管能保證cDNA產物不是由於基因組DNA與寡核苷酸片段的汙染或者由RNA模板分子的自身擴增所致。

總cDNA的合成量通過測定用三氯乙酸(TCA) 沉澱的反轉錄產物中放射性物質的摻入量比活來確定，因而在反轉錄反應中加入了含10~20uCi的[2P] dCTP放射性底物(放射性比活度為3000Ci/mmol)。

實驗要注意離心管內肯定不含有寡核苷酸引物：而RNA分子自身引導的產物沒有放射性活性。第--鏈cDNA分子的大小能通過鹼性瓊脂糖凝膠電泳(參見第2章，方案6)及放射自顯影來鑑定。

為了檢測基因特異性DNA合成的效率，建立了一種引物延伸反應的實驗方法，該方法是將基因特異性反義寡核苷酸引物的5'端用噬菌體T4多核苷酸激酶和[y-P] ATP通過酶促催化反應使引物的5'端帶有放射性標記(參見第6章，方案18)。

反轉錄反應的產物長度通常是不均一的，應該通過鹼性瓊脂糖凝膠電泳(參見第2章，方案6)及放射自顯影來分析鑑定。對於與低豐度mRNA互補的引物延伸產物，放射自顯影壓片時間可能要大於24h。

反轉錄反應完成後，多餘的dNTP和引物必須從反應液中去除。否則，dNTP可能在末端轉移酶作用下不適當地加入到cDNA的3』端，這會干擾3端作為引物結合位點的能力

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