引物合成及各種問題總結

2020-12-11 生物谷

引物合成及各種問題總結

來源:上海申能博彩生物科技有限公司 2007-07-26 09:39

1.引物是如何合成的?
目前引物合成基本採用固相亞磷醯胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產,無論採用什麼機器合成,合成的原理都相同,主要差別在於合成產率的高低,試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。

亞磷醯胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷醯胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。
第一步是將預先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應,脫去其5'-羥基的保護基團DMT,獲得游離的5'-羥基;
第二步,合成DNA的原料,亞磷醯胺保護核苷酸單體,與活化劑四氮唑混合,得到核苷亞磷酸活化中間體,它的3'端被活化,5'-羥基仍然被DMT保護,與溶液中游離的5'-羥基發生縮合反應。
 第三步,帶帽(capping)反應,縮合反應中可能有極少數5'-羥基沒有參加反應(少於2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其後繼續發生反應,這種短片段可以在純化時分離掉。
第四步,在氧化劑碘的作用下,亞磷醯形式轉變為更穩定的磷酸三酯。
經過以上四個步驟,一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護基團DMT,重複以上步驟,直到所有要求合成的鹼基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。
通過氨水高溫處理,連接在CPG上的引物被切下來,通過OPC, PAGE等手段純化引物,成品引物用C18濃縮,脫鹽,沉澱。沉澱後的引物用水懸浮,測定OD260定量,根據定單要求分裝。

2.引物純化方式有哪些,如何選擇?
◆ C18柱脫鹽:有人稱其為簡易反相柱,它對DNA有特異性的吸附,可以被有機溶解洗脫,但不會被水洗脫,所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實際上,它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會對普通PCR反應產生影響。對於需要用於測序、克隆的引物不能使用這個級別。
◆ OPC純化: OPC純化是根據DNA保護基(DMTr基)和Cartridge柱中樹脂間的親合力作用的原理進行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大於95%。適用於40mer以下引物的純化。
◆ PAGE純:PAGE純化法是使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳,對DNA片段進行分離,然後從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法,純化後的DNA純度大於95%,對長鏈Oligo DNA (大於50mer)的純化特別有效。
◆ HPLC純化:HPLC純化是使用高效液相色譜的原理,對DNA片段進行純化。純度可以大於99%。主要用於短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點是成本較高,批量生產效率不高。

3.引物的OD數如何定量?
答:引物合成引物OD數是這樣測定的:用紫外分光光度計,波長260nm,石英比色杯,光程為1釐米,測定溶液的光密度。測定時溶液的光密度最好稀釋到0.2-1.0之間。DNA乾粉用一定體積的水充分振蕩溶解以後,用1ml水稀釋測OD值。需要根據稀釋倍數換算出母液的OD值。
4.需要什麼級別的引物?
答:引物常用的純化方式C18脫鹽,OPC純化,PAGE純化,HPLC純化。根據實驗需要,確定訂購引物的純度級別。
應用  引物長度要求  純度級別要求
一般PCR擴增  < 45base  OPC
  >45 base  PAGE
診斷PCR擴增  < 40base  OPC, PAGE
DNA測序  20base左右  OPC
亞克隆,點突變等  根據實驗要求定  OPC, PAGE,HPLC
基因構建(全基因合成)  根據實驗要求定  PAGE
反義核酸  根據實驗要求定  PAGE
修飾引物  根據實驗要求定  PAGE, HPLC

5.最長可以合成多長的引物?
答:引物越長,出現問題的概率就越大。我們合成過120base的引物,但是產率很低。除非需要,建議合成片段長度不要超過80mer,按照目前的引物合成效率,
80mer的粗產品,全長(還不一定正確)引物的百分比不會超過40%,後續處理還有丟失很多,最後的產量是很低。

6.需要合成多少OD數?
答:根據實驗目的確定。一般PCR擴增,2 OD引物,可以做200-500次50ul標準PCR反應。如果是做基因拼接或退火後做連接,1 OD就足夠了。但是有些研究人員,就做幾次PCR,但是卻要5-10 OD。做全基因構建的引物都比較長,但是我們有些研究人員也要求高OD數。片段越長, 最後全長得率就越低,出錯的機率就越大。超出需要之外的OD數要求,其實也是對社會資源的一種浪費,同時也從一個側面反映了部分研究人員,特別是新手的自信心不足,總覺得需要重複多次才能成功。

7.如何檢測引物的純度?
答:實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯醯胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素乾粉直到飽和,上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性,二是增加樣品比重,容易加樣。600V電壓進行電泳,一定時間後(約2-3小時),剝膠,用螢光TLC板在紫外燈下檢測帶型,在主帶之下沒有雜帶,說明純度是好的。如果條件許可,也可以用EB 染色或銀染方式染色。

8.如何計算引物的濃度?
答:引物保存在高濃度的狀況下比較穩定。引物一般配製成10-50pmol/ul。 溶解前您需要核對合成報告單和引物標籤上的引物OD數是否一致。如果不一致,請和我們聯繫。我們可以根據生產記錄查到實際產量是多少。
一般情況下,我們建議將引物的濃度配製成50pmol/ul,加水的體積(微升)按下列方式計算:V (微升)= OD數*(乘)33 *(乘)*(乘)20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以從合成報告單上獲得。如果需要配製成其他濃度,按上述公式換算。
注意:1 OD260= 33 ug/ml.

9.如何計算引物的Tm值?
答:引物設計軟體都可以給出Tm,引物長度,鹼基組成,引物使用緩衝的離子強度有關。
長度為25mer以下的引物,Tm計算公式為:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
對於更長的寡聚核苷酸,Tm計算公式為:
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中,Size = 引物長度。
Tm的定義:Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.

10.引物(含修飾)的分子量是如何確定的
答:非修飾的引物的Molecular Weight在隨引物提供的報告單上都有明確的標示。如果需要估計一個引物的分子量按每個鹼基的平均分子量為324.5,引物的分子量=鹼基數 x 鹼基的平均分子量。或按下列公式計算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) +(Nx * Wx)+( Ni* Wi) +16* Ns– 62.
NA, NG, NC, NT, Ni分別為引物中鹼基A或G或C或T或I的數量,WA, WC, WG, W, Wi分別為引物中鹼基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod 分別為修飾基團的數目和分子量。
對於混合鹼基的分子量為混合鹼基的分子量總合除以混合數,例如G+A混合的分子量為(313.21+329.21)/2 = 321.21。Ns為硫代數目,硫代每個位置增加分子量16。
常規鹼基分子量
Base  Molecular Weight
A  313.21
C  289.18
G  329.21
T  304.19
I  314.2
U  290.17

常規修飾基團分子量
5』-Biotin  405.45  3』-TAMARA  623.60
5』-(6 FAM)  537.46  3』-Dabsyl  498.49
5』-HEX  744.13  3』-(6 FAM)  569.46
5』-TET  675.24  3』-Amino Modifier C3  153.07
5』-Cy5  533.63  3』-Amino Modifier C7  209.18
5』-Cy3  507.59  3』-Thiol Modifier C3  154.12


11.如何溶解引物?
答:乾燥後的引物質地非常疏鬆,開蓋前最好離心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,將引物粉末收集到管底。根據計算出的體積加入去離子無菌水或10mM Tris pH7.5緩衝液,室溫放置幾分鐘,振蕩助溶,離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水,因為有些蒸餾水的pH值比較低(pH4-5),引物在這種條件下不穩定。

12.如何保存引物?
答:引物合成後,經過一系列處理和純化步驟,旋轉乾燥而成片狀物質。引物在溶解前,室溫狀態下可以長期保存。溶解後的引物-20度可以長期保存。如果對實驗的重複性要求較高,合成的OD數較大,建議分裝,避免反覆凍融。修飾螢光引物需要避光保存。

13.合成的引物5』端是否有磷酸化
答:合成的引物5』為羥基,沒有磷酸基團。如果需要您可以用多核苷酸激酶進行5'端磷酸化,或者要求我們合成時直接在5'或3'端進行磷酸化,需要另外收費。

14.引物片段退火後不能連接到載體上是什麼問題?
連接反應需要引物的5』磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上,引物需要磷酸化。磷酸化的產物如果還不能連接載體上,需要檢查載體的酶切效果,需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結構,退火的難度較大,退火時需要提高退火溫度。

15.測序發現引物有突變是怎麼回事?
答:測序發現引物區域有突變,特別是40個鹼基以下的引物, 發生的概率不大,但是肯定也會發生。用戶一般可以放心,引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列COPY到合成儀的,鹼基輸錯的機會不多。我們有一套控制辦法,預防鹼基輸入錯誤。發生這種突變的原因有很多解釋,人們還沒有辦法徹底解決這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣,採用的機器也基本相同,合成主要原料都是由可數的幾家跨國公司提供的,所有每個合成服務商遇到的問題也基本類似,沒有人可以超脫。
引物合成是一種多步驟的化學反應,合成效率最高也就是99%,副產品不可以避免。引物序列中插入突變往往是鹼基重複,一般認為,偶連過程中,正在偶連的部分單體發生丟失DMT,導致單體又接了上去,故發生插入同一鹼基的突變。至於缺失突變,一般認為是一般認為是帶帽(capping)反應不徹底造成的,Caping反應主要是封閉極少數5'-羥基沒有參加反應單體。被封閉的引物,在下一輪偶連時將不能繼續參與合成。對於鹼基置換的突變,產生的原因一般認為是鹼基不能100%脫保護,即引物上可能含有殘留保護基團,引物的這些區域不能很好地與互補鏈配對,當擴增的產品被亞克隆轉化到大腸桿菌中,可能被細菌中修復系統補上了非配對的鹼基。置換突變通常發生在G 轉換成其它鹼基。鹼基G在一定條件下可以轉化為烯醇異構體 (脫嘌呤),2,6 diaminopurine , DNA複製和擴增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作鹼基A,測序就會發現鹼基G-A置換。脫嘌呤現象在富含嘌呤的引物中發生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物後處理脫保護階段如果被降解,測序就會發現鹼基G或A的缺失。
引物合成過程中,造成鹼基插入,缺失,置換突變的因素客觀存在,有不少降低發生的頻率建議和措施,但是這些措施還停留在實驗室階段,還沒有能夠應用到規模化生產中。

16.長鏈引物為什麼出錯的機率非常高?
答:引物合成時,每一步反應效率都不能達到100%,產生鹼基插入,缺失,置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長,突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失,這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增,不可能絕對保證擴增產物中沒有突變,引物合成也不可能保證100%正確。要知道,引物合成中發生錯誤(非人為因素)的頻率,比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產生的頻率都要高。做引物合成,長鏈引物合成,您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。

17.如果測序發現突變,該如何處理?
答:對您遇到的困惑,我們表示同情。遇到這種情況,首先和我們取得聯繫,我們的生產人員會檢查生產的原始記錄,主要是核對合成序列是否和定單一致,我們在電腦中保留所有原始數據。如果確認引物合成序列沒有輸錯,我們建議重新挑取克隆測序,您可能會找到正確克隆的。根據我們經驗,40個鹼基以下的引物,測1-2個克隆就可以了;40個以上的特別是用於全片段拼接合成的,就需要多測一些了。一般情況下,每個克隆突變的位點都不一樣,提示正確的總是有的,就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費重合一次,不過重合的引物和第一次的引物一樣,都可能含突變,不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的機率。基因拼接過程中,如果發現一段區域突變點不多,就多測幾個,否則就重合一下引物。

18.引物是經過PAGE純化的,為什麼還有鹼基缺失或插入?
答:理論上分析型PAGE變性電泳,可以區分引物之間一個鹼基的差別。但是製備PAGE電泳,上樣量都是非常大,電泳時的條帶非常寬,帶與帶之間有重疊,解析度已下降,電泳後割帶回收目的引物時,很難說不割到差別僅幾個鹼基的引物。國內有一個不好的現象,PAGE純化的引物,特別是長引物要的量都比較高,導致割的條帶有時可能比較寬。建議:您如果減少OD數,引物遇到的問題可能就會少一些。

19. TaqMan 探針設計的基本原則是什麼?
答:下列原則供您參考。
◆TaqMan 探針位置儘可能靠近擴增引物(擴增產物50-150bp),但不能與引物重疊。
◆長度一般為18-40mer 。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免連續相同鹼基的出現,特別是要避免GGGG或更多G出現。
◆在引物的5』端避免使用G。
◆選用比較多的鹼基C。
◆退火溫度Tm控制在 68-70C左右。

有用的螢光染料參數
Name  Name  吸收波長  發射波長  colors
6-FAM  6-carboxy-fluorescein  494nm  518nm  Green
TET  5-tetrachloro-fluorescein  521nm  538nm  Orange
HEX  5-hexachloro-fluorescein  535nm  553nm  Pink
TAMRA  tetramethyl-6-carboxyrhodamine  560nm  582nm  Rose
ROX  6-carboxy-x-rhodamine  587nm  607nm  Red
Cy3  Indodicarbocyanine  552nm  570nm  Red
Cy5  Indodicarbocyanine  643nm  667nm  Violet

20.Primer設計的基本原則是什麼?
答:引物設計的下列原則供您參考。
◆引物長度一般在18-35mer。
◆G-C含量控制在40-60%左右。
◆避免近3』端有酶切位點或髮夾結構。
◆如果可能避免在3』端最後5個鹼基有2個以上的G或C。
◆如果可能避免在3』端最後1個鹼基為A。
◆避免連續相同鹼基的出現,特別是要避免GGGG或更多G出現。
◆退火溫度Tm控制在 58-60C左右。
◆如果是設計點突變引物,突變點應儘可能在引物的中間。

21.為什麼引物的OD260/OD280小於1.5 ?
答:我們多次接到類似的投訴:引物應該全是DNA,但是OD260/OD280的比值為什麼那麼低,怎麼會有蛋白質汙染?遇到這樣的投訴有時我們感到很是為難。投訴者有時心情很不好,還不聽解釋。撇開其他不談,引物化學合成,哪裡有機會汙染到蛋白質?
需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由於引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值與引物的鹼基組成密切相關。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions
Base Composition  A260/280
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3  2.50
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3  1.85
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3  1.15
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3  1.14
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3  1.66

22.同樣的OD用PAGE檢測,EB染色為什麼深淺不一?
答:通常可以用EB染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質粒DNA),因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA,由於鹼基組成不同,形成二級結構的可能性不同,EB的染色程度也會有差異,比如Oligo(dT)等不形成二級結構,EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量,而用紫外分光光度計檢測。同樣道理,用EB染色來照片不適合所有引物。

23.引物不純會有什麼後果?
答:引物不純可能會導致:1)非特異性擴增;2)無法用預先設計在引物5'端酶切位點的酶切開,特別是沒有保護鹼基的引物;3) 用於測序出現雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。

24.為什麼我們的引物重合了幾遍都擴增不出來
答:有些PCR擴增沒有成功,懷疑是引物不好。PCR擴增不成功的因素很多,需要您耐心地分析,最好在實驗時設置對照來判定原因。
如果您懷疑引物的問題,請您首先測定您溶解的引物的OD值,看實驗時加入的引物量是否正確。如果量是正常的,請您告訴我司您的引物編號,我們會複查留存樣品。如不明原因,我們免費為您重新合成一次。如果仍然不能擴增,請您查找其它原因。

25.已經溶解的引物,為什麼原先使用正常,而過一段時間再使用就不好了?
答:如果您溶解引物的水PH過低或汙染了菌或核酸酶,會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合,液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。建議分裝引物,避免反覆凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩衝液溶解引物,因為有些蒸餾水的pH值比較低(pH4-5), 引物在這種條件下不穩定。還有一種可能性是引物沒有問題,而是PCR使用材料特別是模板的質量與先前使用的不完全一致。

26.引物質量好壞的判斷標準是什麼
答:合成的引物和您的定單序列一致,而不是能否擴增出您所需要的產物。

27.PCR擴增不出就引物有問題嗎?
答:基本不是。當今發展出各色各樣的PCR擴增技術,各色各樣的高溫聚合酶,就是來解決PCR擴增中遇到的擴不出,擴增效率低的問題。如槽式PCR就是擴增那些拷貝數很低的基因片段。 有些重複片段的擴增, GC含量高的片段,非要採用特殊擴增手段才能擴增出了。
引物擴增不出,主要是下列兩種情況比較常見(1) RT-PCR。請注意,很多基因通過常規RT –PCR方法是很難不增出來的。 RT- PCR成功的關鍵在於RT的反應的RNA質量和目標基因在特定組織和細胞中含量。(2)從基因組中擴增。一般情況下,基因在基因組中都是單拷貝,基因組作為模板需要嚴格控制用量。基因組DNA過高,會影響反應體系中的Mg和pH。

28.PCR擴增有很強的非特異條帶,說明引物有汙染嗎?
答:不能。瞧,擴增目標很弱或沒有,道是非特異性條帶很亮,說明引物不純或有汙染。一些用戶如是說。我們曾分析過一些非特異條帶,測序發現在這些非特異性片段的兩頭至少可以發現一條引物序列。我們只能說非特異性擴增一般是模板汙染(如RNA中汙染基因組)或擴增條件不合適所致。

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    2.怎樣溶解引物? 我們的的合成報告單給出了每OD引物稀釋為100μmoL/L(即100pmol/ul)濃度的加水量,您可以根椐您的實驗需要加入適量的無核酸酶的雙蒸水(PH>6.0)或TE緩衝液(PH 7.5-8.0),開啟瓶蓋溶解之前最好在3000-4000轉/分鐘的轉速下離心1分鐘,防止開蓋時引物散失。 3.合成的引物應如何保存?
  • 哈佛大學:酶促DNA合成見光
    解決這一懸而未決的全球數據存儲問題的一種方法可能是將DNA(生活中自己的信息存儲系統)開發為數字數據存儲介質。 研究人員已經在將由數字代碼組成的複雜信息編碼為DNA的由A,T,G和C核苷酸鹼基組成的四字母代碼。
  • 有關DNA的複製的所有問題都在這裡(含新舊教材比較)
    我們先看5』→3』的這一條模板鏈,要想利用DNA聚合酶合成DNA鏈則一定要從5』→3』合成,要給DNA聚合酶暴露出3』-OH端讓它往下延伸,而模板DNA鏈的3』端所對應的引物正是5』端,沿著引物正好可以暴露3』-OH端,DNA即可從引物3』-OH端往左合成DNA。
  • 總結,PCR方法—常用的10種策略
    需要注意的是,雖然較高的退火溫度能夠防止引物二聚體形成和非特異性引物結合,但同時也可能加劇引物與目的序列的解離,從而降低PCR得率。為克服這一問題,在最初幾個循環中,通常會將每個循環的退火溫度降低1°C,以獲得足量的目標擴增子。一旦退火溫度達到或「降落」至最佳溫度(通常比最低引物Tm低3-5°C),剩下的循環都維持此退火溫度。
  • 手把手教你另一種設計PCR引物的方法
    6、引物3』端的互補、二聚體或髮夾結構也可能導致PCR反應失敗。7、如擴增編碼區域,引物3』端不要終止於密碼子的第3位,因密碼子的第三位易發生簡併,會影響擴增特異性與效率;8、引物5』端可以修飾。引物5』端序列對PCR影響不太大,因此常用來引進修飾位點或標記物。9、鹼基要隨機分布,且引物自身和引物之間不能有連續4個鹼基的互補。