有很多公式用於計算理論熔解溫度，但是沒有一個能夠對各種長度和序列的引物的熔解溫度進行精確計算。所以，最好是做一系列試驗性 PCR,以探索比熔解溫度低2~ 10C的各種溫度點中哪個溫度是最佳的。
或者，PCR的前幾個循環中復性溫度逐漸降低(參見方案3「降落PCR」) (Don et al.1991)。前者得在不同復性溫度下進行多個PCR反應，而後者的好處在於，在一個PCR反應中試驗不同的復性溫度並找到合適的溫度。
降落PCR解決了每對引物需要試驗最佳復性溫度的問題，經常用於在常規PCR中獲得可靠的產物量。
●引物的延伸。一般在或接近熱穩定DNA聚合酶催化DNA合成的最佳溫度下進行，對Taq DNA聚合酶來說就是72 ~78°C。
在前兩輪PCR中，從一條引物發起的延伸會超越另外一條引物在模板上的結合位點，而後來的產物長度就是兩條引物結合模板位點之間的長度，從第三輪反應開始，兩條引物之間長度的產物幾何級增長，而超過兩條引物之間長度的產物則以正比例方式增長(Mullis and Faloona 1987)。
作為一個經驗法則，每1kb產物，延伸時間為1min.在最後-輪PCR中，許多研究者使用的延伸時間一般為前輪循環延伸時間的3倍，表面上是為了讓所有的擴增產物最終完成延伸。但是，我們的實驗顯示，延伸時間進行這樣的調整不會顯著改變PCR的結果。
●循環數。如在信息欄「PCR理論」中討論的那樣，循環數取決於PCR起始時存在的模板數及引物延伸和擴增的效率。