攜帶紅色螢光蛋白的RU486可誘導真核表達載體的構建及其表達

2020-12-22 生物谷

《生物工程學報》

攜帶紅色螢光蛋白的RU486可誘導真核表達載體的構建及其表達

陳堅1, 薛緒潮2, 方國恩2, 蘇長青3, 錢其軍3

1 解放軍第81 醫院腫瘤外科, 南京 210002

2 上海第二軍醫大學附屬長海醫院, 上海 200433

3 東方肝膽醫院病毒基因治療實驗室, 上海 200438

摘  要: 在基因治療中, 實現目的基因的調控表達是非常重要的。然而, 傳統基因載體的無調控地持續或不適當的表達會影響治療效果, 甚至可能帶來致命的副作用。在本研究中, 我們構建了一種帶有DsRed紅色螢光蛋白報告基因並可經RU486誘導的真核表達載體, 並在體外評估了其調控表達作用。利用分子生物學技術, 將DsRed基因和啟動子, 以及RU486系統構建成單一的質粒載體PDC-RURED, 為減少RU486調控元件和基因表達元件之間的相互幹擾, 在兩者之間加入1.6 kb的絕緣子。經PCR檢測和限制性酶切分析及序列測定均證實了載體的正確性。在轉染HEK293細胞後, 運用螢光顯微鏡和流式細胞技術證實了該載體的調控能力。沒有RU486時, 幾乎沒有紅色螢光蛋白的表達, 而加入誘導劑RU486後, 最高可以實現紅色螢光蛋白的40餘倍的表達。實驗結果表明構建的可經RU486誘導的新型真核表達載體可以實現對目的基因的表達時間和表達水平的調控, 為進一步的基因調控研究和和基因治療提供了良好的工具。

關鍵詞: RU486, 誘導表達, 基因調控, 紅色螢光蛋白

Construction and Expression in vitro of an RU486 Inducible Vector Carrying DsRed Protein

Jian Chen1, Xuchao Xue2, Guoen Fang2, Changqing Su3, and Qijun Qian3

1 Department of Oncological Surgery, the 81st Hospital of PLA, Nanjing 210002, China

2 Department of General Surgery Changhai Hospital, The Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

3 Laboratory of Viral and Gene Therapy Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital, The Second Military Medical University, Shanghai 200438, China

Abstract: The regulation of a target gene expression is very important in gene therapy. However, constitutive or inappropriate expression of the genes with traditional expression system may interfere with the effect of the gene therapy, even may lead to lethal side effect. We constructed an RU486 inducible eukaryotic vector carrying DsRed protein and evaluated its regulatable effect in vitro. The single vector named PDC-RURED was constructed with molecular biological methods, which contained DsRed gene, promoter and RU486-inducible system. To minimize any potential interference, we spaced the two transcriptional elements with a 1.6 kb insulator. The vector was identified by different enzyme restrictions, sequencing analysis and PCR assay. We demonstrated the regulatable expression of this vector after transfection in HEK293 cells by fluorescence microscopy and flow cytometry. In the absence of RU486, no significant DsRed protein activation was observed, whereas in the presence of RU486 up to 40 fold activation of the DsRed protein was observed in cultured cells. The data show that the novel eukaryotic expression plasmid vector can be used to regulate the expression level of genes of interest in appropriate time under the control of RU486. This inducible expression vector provides a powerful tool for the research of gene regulation and gene therapy.

Keywords: RU486, inducible expression, gene regulation, DsRed

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