NCB|楊輝/周海波組開發新型基因表達動態示蹤技術

2021-01-07 BioArt生物藝術

責編 | 兮

在活細胞中實時監測內源基因活性對於研究基因的生物學功能及其表達水平至關重要。基因組中編碼蛋白質的基因只有1%-2%,大部分為非編碼RNA。其中lncRNAs(Long non-coding RNAs)具有非常重要的調控功能, 多達78% 的lncRNAs表達具有組織特異性【1】。近年來越來越多證據表明,lncRNAs不僅參與各種生物學過程和通路,而且與各種疾病的發生發展緊密相關。但是受現有標記技術的限制,對其功能注釋極具挑戰性。

監測內源基因活性的常規方法是將螢光蛋白精確插入蛋白編碼框中,但是,這種方法並不適用於非編碼基因和低豐度轉錄的基因。sgRNA,類似於一個GPS可以將Cas核酸酶直接導向目標核酸位點,具有高特異性、高效率和多功能性【2】。儘管各種誘導性sgRNA已經被開發用來接收活細胞中的內源信號,但這些方法只能用於某些功能明確的小RNA的反應【3-5】。目前在活細胞裡面標記內源基因表達的方法,都具有一定的局限性,而且,對於低表達的基因以及lncRNA,目前缺乏很好的活細胞內的標記技術。建立適用範圍更廣,能增強內源信號,並且信噪比更低的新型活細胞標記技術,是該研究領域急需解決的問題。

2021年1月4日,中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心(神經科學研究所)、上海腦科學與類腦研究中心、神經科學國家重點實驗室楊輝研究組和周海波研究組合作在Nature Cell Biology在線發表了題為「Endogenous promoter-driven sgRNA for monitoring the expression of low-abundant genes and lncRNA」的研究論文。該研究通過內源基因的啟動子驅動sgRNAs(single-guide RNAs)表達,結合SPH-OminiCMV(CRISPR-activator Suntag-P65-HSF1 and OminiCMV-mCherry)螢光報告系統【6】,成功實現低豐度基因和lncRNAs基因表達的動態示蹤。該研究建立了一種通用的內源基因轉錄門控系統,為活細胞中實時標記低表達基因和lncRNAs,研究其生物學功能提供了有效工具。

該研究中,研究人員首先優化了高度敏感的CRISPR激活相關的報告系統,命名為SPH-OminiCMV。然後在小鼠胚胎幹細胞上建立了SPH-OminiCMV的穩轉株(圖1A),接著選擇在Actb基因的第一個內含子區域用SaKKHCas9介導了三種不同的sgRNA釋放機制,分別是:miR30【7】, autosplicing【8,9】or tRNA【10-12】(圖1B)。結果顯示只有tRNA能夠有效地誘導報告系統中的mCherry表達。如先前報導的【10-12】,可以將tRNA-sgRNA-tRNA前體插入外源基因中,並通過內源酶RNase P和RNase Z在特定位點精確切割,然後釋放sgRNA。那麼,在內源基因的什麼位置導入tRNA-sgRNA-tRNA前體才能誘導報告系統更好的表達呢?以及是否會對內源基因的表達造成影響呢?為了回答這兩問題,研究人員在Nanog基因的不同位點導入tRNA-sgRNA-tRNA前體,實驗結果顯示在3』UTR的效果更好並且更加穩定,並且western blot的結果顯示對內源基因的表達量基本沒有影響(圖1C-F)。

圖1:(A)小鼠胚胎幹細胞上建立了SPH-OminiCMV穩轉株。(A)在Actb的第一個內含子導入三種不同的sgRNA釋放機制。(C)在Nanog基因的不同位點導入tRNA-sgRNA-tRNA前體。(D)不通導入位點誘導報告系統mCherry的表達情況。(E)Nanog基因的不同位點導入tRNA-sgRNA-tRNA前體後對nanog的蛋白表達量進行檢測。

就此楊輝研究組和周海波研究組合作開發了一種廣譜的內源性轉錄門控開關Ents(Endogenous Transcription-Gated Switch),利用內源性啟動子表達sgRNA前體,之後sgRNA前體上的tRNA序列可以被內源的自剪切機制識別並且切割,進而釋放出能夠執行功能的sgRNA,當Ents與高度敏感的CRISPR激活相關的報告系統SPH-OminiCMV結合,可以監測到內源基因的表達(圖2A)。值得注意的是,SPH-OminiCMV-Ents能夠放大內源信號,從而實現低豐度轉錄本表達的可視化。

為進一步研究SPH-OminiCMV-Ents用於監測內源基因的能力,團隊選取了表達量從高到低的八個基因,發現SPH-OminiCMV-Ents誘導的mCherry表達水平普遍高於常用的P2A-mCherry標記策略,尤其是P2A-mCherry策略標記後在螢光顯微鏡下幾乎無信號的低豐度表達基因Sox2、Tet1、Sall4、Tbx3等(圖2B)。

為探討增加sgRNA拷貝數是否會進一步增強螢光蛋白的產生,團隊構建了一個sgRNA前體,包含六到八個串聯的sgRNA拷貝,每個sgRNA的兩側分布著tRNA序列(圖2C)。研究表明,插入sgRNA陣列可以對低豐度基因實現更好的監測,比如lncRNATug1,當僅用一個拷貝的sgRNA的時候不能監測到其表達,但使用sgRNA陣列則可以(圖2D,E)。

為進一步探討此方法的特性,團隊成員建立了一個可控的Tet-on系統,該系統可以通過調節dox的濃度,實現EGFP基因不同程度的表達量,進而用來研究報告系統的螢光信號強度是否可以很好地反映目標基因的表達水平。研究發現,報告系統的mCherry表達量和EGFP基因的表達量有很強的相關性,並且進一步探索了此報告系統和目標基因表達在轉錄本水平和蛋白翻譯水平存在的時間差(圖2F)。

圖2:(A)示意圖顯示P2A-mcherry和SPH-OminiCMV-Ents兩種標記基因的策略。(B)在mESC細胞中用SPH-OminiCMV-Ents策略(紅色三角形)和P2A- mCherry策略(綠色菱形)標記不同的基因,統計其mCherry螢光信號強度以及用qPCR分析這些基因的表達水平(紫色圓圈,紫色y軸)。(C)示意圖顯示插入一個sgRNA或一個sgRNA陣列的標記策略。(D,E)Fish圖像顯示對lncRNA Tug1在3'UTR中插入一個sgRNA或一個sgRNA陣列後,細胞系中mCherry報告螢光信號的表達情況。(F)可控的Tet-on系統示意圖,Dox誘導EGFP-sgRNA前體轉錄,成熟的sgRNA釋放出來激活mcherry報告系統。

那麼對於內源基因的表達變化,該系統是否也能靈敏地檢測到呢?研究人員在體外對SPH-OminiCMV-Ents-Actb,Actb-P2A-mCherry,SPH-OminiCMV-Ents-Nanog 和Nanog-P2A-mCherry四株細胞系進行了分化實驗【13】。再分化進程中,Actb的表達量不會改變,Nanog的表達量逐漸降低,而報告系統的mCherry表達量和目的基因的表達變化是一致的,這說明這一系統能夠反映內源基因表達的動態變化(圖3A-D)。

圖3:(A)-(D) SPH-OminiCMV-Ents-Actb ,Actb-P2A-mCherry,SPH-OminiCMV-Ents-Nanog 和Nanog-P2A-mCherry四株細胞系在分化進程中,報告系統中mCherry的表達情況變化圖和Actb,Nanog內源基因mRNA水平表達的變化情況。

該研究創新開發了由內源性啟動子驅動的高度可編程的sgRNA門控開關Ents,此系統理論上可以處理任何轉錄本的信息。研究人員將Ents與SPH-OminiCMV結合使用,在小鼠胚胎幹細胞水平上實現了對低豐度基因和lncRNA的可視化監測及其動態變化的監測,未來的工作會進一步應用於動物體內。該研究為在活細胞中研究基因元件的功能開闢了新途徑,為描繪基因表達的時空圖譜和標記、鑑定特定的細胞類群帶來新方法。

原文連結:

https://doi.org/10.1038/s41556-020-00610-9

參考文獻

1. Cabili, M. N. et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev25, 1915-1927, doi:10.1101/gad.17446611 (2011).

2. Hsu, P. D., Lander, E. S. & Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.Cell157, 1262-1278, doi:10.1016/j.cell.2014.05.010 (2014).

3. Siu, K. H. & Chen, W. Riboregulated toehold-gated gRNA for programmable CRISPR-Cas9 function. Nat Chem Biol15, 217-220, doi:10.1038/s41589-018-0186-1 (2019).

4. Wang, X. W. et al. A microRNA-inducible CRISPR-Cas9 platform serves as a microRNA sensor and cell-type-specific genome regulation tool. Nat Cell Biol21, 522-530, doi:10.1038/s41556-019-0292-7 (2019).

5. Miki, K. et al. Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches. Cell Stem Cell 16, 699-711, doi:10.1016/j.stem.2015.04.005 (2015).

6. Zhou, H. et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nat Neurosci21, 440-446, doi:10.1038/s41593-017-0060-6 (2018).

7. Wang, J. et al. Generation of cell-type-specific gene mutations by expressing the sgRNA of the CRISPR system from the RNA polymerase II promoters. Protein Cell 6, 689-692, doi:10.1007/s13238-015-0169-x (2015).

8. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem 72, 291-336, doi:10.1146/annurev.biochem.72.121801.161720 (2003).

9. Matlin, A. J., Clark, F. & Smith, C. W. Understanding alternative splicing: towards a cellular code. Nat Rev Mol Cell Biol6, 386-398, doi:10.1038/nrm1645 (2005).

10. Xie, K., Minkenberg, B. & Yang, Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 3570-3575, doi:10.1073/pnas.1420294112 (2015).

11. Zhang, D. et al. Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases. Genome Biol 18, 191, doi:10.1186/s13059-017-1325-9 (2017).

12. Nissim, L., Perli, S. D., Fridkin, A., Perez-Pinera, P. & Lu, T. K. Multiplexed and programmable regulation of gene networks with an integrated RNA and CRISPR/Cas toolkit in human cells. Mol Cell54, 698-710, doi:10.1016/j.molcel.2014.04.022 (2014).

13. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M. & Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol21, 183-186, doi:10.1038/nbt780 (2003)

相關焦點

  • 【學術前沿】楊輝/周海波組開發新型基因表達動態示蹤技術實時標記...
    目前在活細胞裡面標記內源基因表達的方法,都具有一定的局限性,而且,對於低表達的基因以及lncRNA,目前缺乏很好的活細胞內的標記技術。建立適用範圍更廣,能增強內源信號,並且信噪比更低的新型活細胞標記技術,是該研究領域急需解決的問題。
  • 科學家建立一種基因表達動態示蹤的新技術
    2021年1月5日,Nature CellBiology期刊在線發表了題為《通過內源性啟動子驅動的sgRNA監測低豐度轉錄本和lncRNAs的表達》的研究論文,該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心(神經科學研究所))、上海腦科學與類腦研究中心、神經科學國家重點實驗室楊輝研究組和周海波研究組合作完成
  • 新方法讓「沉默」基因「說話」—新聞—科學網
    近日,中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心(神經科學研究所)、上海腦科學與類腦研究中心、神經科學國家重點實驗室研究員楊輝研究組和周海波研究組合作,通過內源基因的啟動子驅動嚮導RNA(sgRNA)表達,結合SPH—OminiCMV螢光報告系統,成功實現lncRNAs基因和低豐度基因表達的動態示蹤。
  • 「雙劍合璧」——李大力組開發新型雙鹼基基因編輯器
    點評 | 左二偉(中國農科院農業基因組研究所)、楊輝(中科院神經所)責編 | 兮新型基因編輯器A&C-BEmax就像是哪吒,他可以用混天綾找到固定突變位點該研究將人類胞嘧啶脫氨酶hAID-腺嘌呤脫氨酶-Cas9n(SpCas9 D10A突變體)融合在一起,開發了一種新型雙功能高活性鹼基編輯器-A&C-BEmax,它可以在同一等位基因的靶序列上實現C>T和A>G的高效轉換。
  • 多篇文章解讀示蹤技術在多疾病領域的研究進展
    示蹤技術是利用放射性或非放射性標記物在體內或體外跟蹤其行徑、轉變和代謝等過程的一種技術,近年來科學家利用示蹤技術在多種疾病的研究上取得了重要的成果,本文中,小編對近年來和示蹤技術相關的研究進展進行了整理,分享給大家!
  • 破譯中國人基因密碼:「中國十萬人基因組計劃」將在4年內完成
    南方人為什麼比北方人免疫力更強中科院神經科學研究所研究員楊輝向《中國經濟周刊》記者介紹說:人類每個基因的DNA序列略有差別,這樣的差別導致基因表達量的差異,微量的變化加上多基因的組合,就會導致不同的特徵,「比如,有時候是單基因的改變,像血型、單眼皮或雙眼皮等;有時是多基因改變,像膚色、身高、體重
  • 加州大學付向東教授控訴80後明星教授楊輝學術抄襲、造假
    主要研究方向包括RNA加工與調控、microRNA的生物發生和功能、轉錄和mRNA加工偶聯、功能基因組學、基因表達的遺傳學和表觀遺傳學調控。付向東在美國已獲得專利兩項,在國際學術期刊發表論文100多篇,其中包括12篇Cell、9篇Nature、3篇Science。
  • 不僅是DNA,基因編輯脫靶還會造成RNA突變!好在上海科學家讓單鹼基...
    「基因編輯技術若使用得當,是能造福人類的,利用這一技術,我們可以改良植物性狀,治療惡性疾病,甚至復活滅絕物種也並非天方夜譚。」楊輝表示。目前,科研人員已經開發了幾種基因組編輯方法。CRISPR/Cas9就是其中的代表——Cas9酶在基因組DNA的引導下對目標基因進行敲除、添加等編輯操作。隨著研究的深入,科學家們發現CRISPR/Cas9存在脫靶風險。
  • 發現單鹼基基因編輯造成大量脫靶並開發出優化解決方法
    完成單位:中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心/神經科學研究所   CRISPR/Cas9及其衍生工具是廣泛應用的新一代基因編輯工具。然而,其脫靶風險一直備受關注,也是阻礙該技術應用於臨床的主要瓶頸之一。
  • ...Molecular Biology:擬南芥基因組水平組蛋白修飾與基因表達研究
    該文章通過ChIP-chip技術, 對擬南芥基因組水平組蛋白修飾與基因表達之間的關係進行了研究。組蛋白H3的賴氨酸9位點可以被乙醯化及單、二或三甲基化,這些組蛋白的修飾狀態對基因的表達以及染色質的組織結構有一定的影響。在擬南芥中,H3K9ac幾乎毫無例外地與轉錄激活相關,而H3K9me2則主要位於組成型異染色質區。
  • 科學家開發用於細胞免疫療法基因組改造的集合敲入技術
    科學家開發用於細胞免疫療法基因組改造的集合敲入技術 作者:小柯機器人 發布時間:2020/4/20 13:06:23 近日,美國加州大學舊金山分校Alexander Marson、Theodore L.
  • 研究人員開發出新型Cas9核酸酶 提高基因編輯安全性
    CRISPR/Cas9基因編輯技術問世以來已經在很多領域得到廣泛的應用。利用這一技術開發的基因療法在醫療健康領域中具有巨大的應用前景。CRISPR/Cas9技術能夠對基因組在指定位點進行基因編輯,但是對這項技術的一個常見的憂慮是擔心基因編輯會在不該出現的地方發生。
  • 楊輝再發聲明:承認聽取付向東報告後受其「鼓舞」,為沒及時溝通向其致歉
    有關 「CasRx介導膠質細胞向神經元轉分化治療神經系統疾病」 的說明在這份最新聲明中,楊輝先介紹了在今年 4 月發表的 Cell 論文中選擇新型基因編輯系統 CasRx 的原因:2018年3月,Cell 雜誌發表了新型基因編輯系統 CasRx,我們意識到CasRx 可能非常適用於採用基因敲低的方法來做轉分化研究和各種神經退行性疾病的治療。
  • B肝新藥動態,基因編輯靶向HBx,AASLD介紹非抗病毒療法
    B肝新藥動態,基因編輯靶向HBx,AASLD介紹非抗病毒療法具體公布試驗內容是這樣的,來自Gautam Buddha大學等研究人員共同發表了使用基因編輯技術CRISPR/Cas9,設計合成HBx基因特異性微小RNA(sg RNA),在體外研究其對B肝病毒基因組整合的肝癌細胞的HBx表達、B肝表面抗原水平等特性。
  • 獨家|基因治療載體AAV「安全神話破滅」?6位專家全方位解讀
    大家現在默認 AAV 是絕對安全、完美的,這其實並不準確,AAV 遠非完美,還有很多可以改進的地方,靜下心來做基礎性研究很有必要;另一方面,目前基因治療的技術也非常多,國內公司也可以開發迭代的載體技術。」在技術層面,該如何做出優化和改進?楊輝認為,對於基因編輯介導的基因治療來說,並不需要長期基因編輯工具的表達。
  • 動物所開發新型基因組編輯工具CRISPR/Cas12b
    她/他們利用Cas9系統有效地實現了哺乳動物基因組的編輯,並帶動了基因編輯領域的迅猛發展,將基因編輯技術成功拓展到基因轉錄表達調控、表觀遺傳修飾、全基因組功能篩選、鹼基編輯、基因組成像和細胞譜系追蹤等多種生物學應用。
  • 【學術前沿】劉光慧等通過全基因組篩選發現新型衰老驅動基因
    該研究首次利用全基因組CRISPR/Cas9篩選體系在人間充質幹細胞中鑑定出新的衰老調控基因,並在此基礎上開發了可以延緩機體衰老的新型「基因療法」。這項工作大大擴展了人們對於衰老基因的認識,為延緩衰老、防治衰老相關疾病提供了重要的幹預靶標與新型策略。
  • 生物學家付向東首次回應:與神經所楊輝論文爭議始末
    知識分子:就你所知道的,楊輝什麼時候開始關注到PTBP1因子的?付向東:應該是在2018年6月聽完報告後,這是楊輝第一次知道有PTB這個基因的存在,當然也是第一次聽到敲降PTB可高效地在小鼠大腦中將神經膠質細胞轉化成神經元,以達到治療的效果。
  • 加州教授付向東實名舉報中科院明星學者楊輝抄襲並造假,後者否認
    其研究重心在基因表達在轉錄和轉錄後水平上的整合調節。因其在生物醫學領域的傑出貢獻,付教授分別於 1994 年榮獲 Searle 學者獎、1997 年榮獲白血病和淋巴癌社會學者獎,並於 2010 年當選美國 AAAS 會士。付向東在 《自然》、《科學》、《細胞》期刊上發表超過 20 項研究。