1. UPLC-MS分析蘋果在四個發育階段的代謝動態
為了研究蘋果發育過程中的代謝變化，作者採用基於LC-MS對蘋果的四個發育階段進行了代謝分析。如圖1A所示，不同發育階段的果實樣品表現出明顯的分離，每個果實發育階段的三個重複具有相似的PC評分，表明果實代謝產物在不同發育階段呈現出不同的變化，並且在重複之間表現出較小的分離。經過鑑定和分析，作者共檢測出462種代謝物，代謝物歸為不同類別，包括胺基酸及其衍生物、碳水化合物、有機酸、醇和多元醇、脂類、核苷酸及其衍生物、花青素和原花青素、黃酮、黃酮醇、黃烷酮、奎寧酸及其衍生物、植物激素等，如圖1B所示，並通過層次聚類進一步分析，結果表明每個果期的三個重複聚集在一起，表明組內的差異很小。熱圖結果顯示，超過一半的代謝物在PS1期的含量高於其他階段，這種現象主要是由於PS1經歷細胞分裂，PS2至PS4階段進行細胞擴張，從而對代謝物含量產生稀釋作用；另一方面，一些代謝物在蘋果的完全成熟階段PS4表現出高積累水平（圖1B中的箭頭），表明這些代謝物的積累與蘋果的成熟過程有關。此外，根據四個發育階段間代謝物的變化作者進行聚類分析（圖1C），20個簇顯示了代謝物變化的明顯聚集，變化趨勢如圖1D所示。
圖1 蘋果發育和成熟的動態代謝組研究
(A)果實四個發育階段代謝組學數據的主成分分析。「mix」是所有水果樣品的均衡混合。(B)蘋果四個發育階段的代謝產物熱圖。顏色表示UPLC-MS通過平均峰值響應區確定的不同發育階段各代謝產物的相對含量。(C)對462種代謝產物在果實發育4個階段的變異趨勢進行聚類分析。(D)對20種代謝產物的變異趨勢進行聚類分析。PS1、2、3和4表示蘋果發育的4個階段：PS1代表花後27天；PS2代表花後84天；PS3代表花後125天；PS4代表花後165天。
2. 蘋果發育和成熟過程的初級代謝產物研究
2.1 糖、糖醇及其磷酸鹽的代謝
蘋果中主要的可溶性糖是果糖（Fru）、蔗糖（Suc）和葡萄糖（Glu）。這三種可溶性糖的含量變化趨勢相似，從PS1到PS2都有明顯的快速上升，從PS2到成熟期略有增加（圖2）；此外，松三糖和阿拉伯糖的含量也呈現出與上述三種主要可溶性糖相似的變化趨勢。結果表明，決定果實甜度的糖積累主要發生在PS1～PS2階段，就糖醇而言，山梨醇、甘露醇和半乳糖醇的含量在前三個階段呈現平穩變化，但在完全成熟階段PS4下降（圖2），然而，脫水葡萄糖醇的含量從PS1迅速上升到PS2，並且在隨後的三個階段中變化很小。對於磷酸糖而言，大多數磷酸糖在PS1處表現出明顯的高積累水平，並在隨後的階段迅速下降至低含量，然而，葡萄糖酸內酯的含量呈上升趨勢，古洛內酯在果實發育過程中表現出較小的變化（圖2）。
圖2 UPLC-MC在4個果實發育階段檢測糖代謝產物
分析了蘋果開花後27天(PS1)、84天(PS2)、125天(PS3)和165天(PS4) 4個果實發育階段。以開花後27天的第一階段為校準，Fructose#是指額外使用GC-MS檢測果糖含量，因為研究中沒有使用廣泛靶向的LC-MS代謝組學方法來鑑定果糖。
2.2 蘋果發育過程中的有機酸代謝
蘋果酸的含量隨著果實的發育和成熟而不斷下降（圖3A）。琥珀酸在果實發育過程中的積累量也呈現出明顯的下降趨勢，從果實早期PS1到果實膨大期PS2迅速下降；同樣，α-酮戊二酸的含量在PS1時顯著升高，隨後迅速下降；富馬酸也呈現出這種變化趨勢，在PS1處積累了大量的富馬酸，並在隨後的三個階段將其含量降至未檢出水平；然而，檸檬酸的含量在四個果實發育階段表現出有限的變化（圖3A）。綜上所述，上述有機酸是TCA循環的中間產物，在果實發育過程中，它們的含量通常會明顯降低。
此外，莽草酸含量在果實發育過程中呈下降趨勢，在PS2時迅速下降。而酒石酸和抗壞血酸在PS4成熟期積累到較高水平。對於奎寧酸及其衍生物，四個時期的綠原酸和新綠原酸含量變化有限，而奎寧酸含量隨著果實發育而明顯下降（圖3A）。其它有機酸和奎寧酸衍生物的變化如圖3B所示，大量的有機酸在成熟階段PS4積累到較高水平；然而，大多數奎尼酸酯衍生物在果實早期PS1呈現出高積累水平（圖3B）。
圖3 四個果實發育階段有機酸和奎寧酸(及其衍生物)的變化
(A) 15種代表性有機酸的熱圖:以開花後27天的第一階段(DAA)為校準，在熱圖上顯示4個階段各代謝物的倍數變化。PS1、2、3和4分別代表花後27、84、125、165天的果實發育階段。Fructose#是指額外使用GC-MS檢測果糖含量，因為研究中沒有使用廣泛靶向的LC-MS代謝組學方法來鑑定果糖。
2.3 胺基酸及其衍生物的積累
圖4顯示了水果發育過程中胺基酸及其衍生物的變化，包括26個胺基酸和39個胺基酸衍生物。胺基酸的積累概況如圖4所示，作者根據胺基酸的變化趨勢將其進一步劃分為四大類。第1組(紅框)表現為在成熟期PS4積累水平較高，呈上升趨勢，第1組包括天冬醯胺、蘇氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、賴氨酸、天冬氨酸、穀氨酸和組氨酸。第2組(藍框)在整個果實發育過程中積累量呈下降趨勢，主要由亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸、高半胱氨酸、酪氨酸和絲氨酸組成。第3組(綠框)呈單一的s型趨勢，在PS2期達到高峰，第3組以酪氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸為主(圖4)。第4組(紫框)前3期PS4積累量呈下降趨勢，成熟期PS4積累量增加，主要由均穀氨酸、纈氨酸、戊氨酸、色氨酸、鳥氨酸和瓜氨酸組成。而異亮氨酸積累水平在PS2時下降至最低點，隨後上升，在PS4時達到最高水平(圖4)。
圖4的熱圖顯示了在果實發育過程中胺基酸衍生物的積累變化。一般來說，檢測到的大部分胺基酸衍生物在PS1早期表現出較高的積累水平，但也有一些是例外，在PS1中含量較低，如乙醯色氨酸、蛋氨酸亞碸等；此外，果實成熟期PS4中α-乙醯-l-穀氨醯胺、n-乙醯-1-亮氨酸和n-乙醯天冬氨酸等多種胺基酸衍生物積累大量(圖4)。
圖4 UPLC-MC在四個果實發育階段檢測到胺基酸(左)及其衍生物(右)
以開花後27天第一階段(DAA)為校準，在熱圖上顯示了4個階段各代謝物的倍數變化。PS1、2、3和4分別代表花後27、84、125、165天的果實發育階段。
2.4 蘋果發育和成熟過程中次生代謝產物的積累
在這項研究中檢測到許多次級代謝化合物，特別是黃酮類化合物。初步鑑定出207種次生代謝物，其中黃酮類化合物104種，其他次生代謝物103種（其中未分類代謝物25種）。作者將次級代謝物分為這兩類，並在圖5中用熱圖顯示出來。
圖5 UPLC-MC檢測到的黃酮類和其他次生代謝產物在四個果實發育階段的積累譜圖
PS1、2、3和4分別代表花後27、84、125和165天的果實發育階段。每個階段都進行了3個獨立的重複。
2.4.1 次生代謝產物(黃酮除外)的積累
（1）苯甲酸類
作者首先對苯甲酸和羥基肉桂醯衍生物在蘋果中的積累進行了分析（圖5）。對苯甲酸而言，氨基苯甲酸、2,5-二羥基苯甲酸-O-己糖苷、沒食子酸O-己糖苷和丁香酸O-葡萄糖苷在果實早期PS1積累量最高，在隨後的三個階段積累量較低。然而，苯甲酸在PS3處出現峰值積累水平，在PS4處出現最低水平（圖6）。香蘭素含量呈上升趨勢，在PS4處含量最高，而沒食子酸則隨四個階段呈下降趨勢（圖5和圖6）。
圖6 在四個果實發育階段檢測到的具有代表性的次生代謝物
以開花後27天第一階段(DAA)為校準，在熱圖上顯示了這4個階段各代謝物的倍數變化。PS1、2、3和4分別代表花後27、84、125、165天的果實發育階段。每個階段都進行了3個獨立的重複。
（2）羥基肉桂醯衍生物
實驗中總共有25個代謝物被劃為羥基肉桂醯衍生物。在果實早期PS1積累了豐富的羥基肉桂醯衍生物，如阿魏醯丁香酸、咖啡醛等。同樣，咖啡酸、阿魏酸、香豆酸和香草酸的積累水平呈現一個下降的趨勢在果實發育(圖5和6)，然而，少量的代謝物在PS4成熟階段高水平積累(圖5)。
（3）多胺
多胺的積累水平的三種類型表現出不同的變化趨勢：PS1和亞精胺積累了最高水平迅速下降到一個很低的水平以下階段；精胺在水果開發過程中變化平穩，在PS3上略有下降；腐胺在前三個階段呈下降趨勢，在PS3時最低，在PS4時呈上升趨勢(圖6)。
（4）激素
有6種代謝產物被鑑定為植物激素，其中3種常見的植物激素為IAA(吲哚3-乙酸)、JA(茉莉酸)和ABA(脫落酸)。IAA積累在PS1期表現為較低水平，在果實膨大階段PS2迅速增加至峰值水平，然後在果實成熟階段PS3和PS4下降至較低水平。JA含量從PS1到PS2迅速下降，PS3和PS4中JA含量維持在較低水平，但在果實成熟階段(PS1到PS3) ABA積累水平呈上升趨勢，在PS3達到峰值(果實開始成熟著色)，從PS3到完全成熟階段PS4 ABA積累水平略有下降，表明ABA在果實成熟過程中發揮了一定的作用(圖6)。
2.4.2 類黃酮代謝
黃酮類化合物的代謝是蘋果中含量最豐富的一類次生代謝產物。共有104種代謝物歸入黃酮類，在此，作者闡述了不同類黃酮在果實發育過程中的變化。
（1）黃酮和黃酮c-糖苷
在104種代謝產物中有41種歸屬於黃酮和黃酮C-糖苷。在果實發育過程中，黃酮和黃酮C-糖苷的變化是動態的，例如，麥黃酮在前兩個階段含量較高，在PS3時最低，在PS4時略有增加。木犀草素、天麻黃酮、白楊素等在PS1積累最多，隨後迅速下降，然而，川皮苷和橘皮素在PS2和PS3處表現出較高的積累水平，而在PS1和PS4處的積累水平較低（圖5和圖6）。與黃酮類化合物相比，果實發育過程中黃酮C-糖苷的變化更為複雜，各成員之間的共同變化趨勢有限；然而，四種木犀草素C-糖苷在成熟期PS4積累了較高的含量（圖5）。
（2）黃酮醇
共有29種代謝物歸屬於黃酮醇類。多數黃酮醇在果實發育過程中呈現出相似的變化規律：在果實早期PS1積累高水平，在果實後期迅速下降，PS3階段最低，然後在成熟期PS4略有上升（圖5）。這種變異模式包括常見的黃酮醇，如槲皮素、山奈酚、二氫山奈酚、楊梅素、紫杉醇、三葉草素等，但部分黃酮醇在成熟期PS4表現出較高的積累水平，如甲基槲皮素O-己糖苷、異鼠李素O-己糖苷、異鼠李素5-O-己糖苷、槲皮素7-O-蘆丁苷、蘆丁、刺槐素等（圖5）。
（3）黃烷酮
11種黃酮在4個發育階段的積累規律基本一致。這11種黃酮含量分別為：新橙皮苷、柚皮苷、櫻桃甙、柚皮素、根皮素、聖草酚、橙皮苷5- o -葡萄糖苷、橙皮苷、柚皮素查爾酮、枸橘苷和阿夫兒茶精，三種代表性黃酮(柚皮素、根皮素和草二醇)的倍數變化如圖6所示。
（4）原花青素和花青素
原花青素，也被稱為縮合單寧，廣泛分布在許多類型的水果中，並被認為發揮不同的作用，包括抗氧化。花青素是成熟蘋果呈紅色的主要天然色素，除原花青素A2外，原花青素A1、B2和B3在PS1中積累量較高，在成熟期PS4積累量較低。原花青素A2在PS1中含量極低，在PS2 ~ PS4中含量較高(圖5、6)。在花青素方面，本研究檢測到三種花青素，分別是松香苷o -己糖苷、花青素3- o -葡萄糖苷和花青素o -丁香酸。松香苷o -己糖苷在PS1中積累量最高，隨後迅速下降，花青素3- o -葡萄糖苷和花青素o -丁香酸在PS1和PS4成熟期積累量較高，而在PS2和PS3期積累量極低(圖6)。
（5）兒茶素衍生物和異黃酮
兒茶素衍生物是一種天然苯酚和從兒茶中提取的抗氧化劑。本研究共檢測到10種兒茶素衍生物。大多數兒茶素衍生物在果實早期PS1積累較高水平，在PS3和PS4積累較低水平，例如，兒茶素和表兒茶素的積累水平在四個階段中呈下降趨勢，在PS3和PS4水平較低，而原兒茶酸o -葡萄糖苷的含量則隨著果實發育而增加(圖5)。異黃酮類有5種代謝物，隨著果實發育呈現出不同的變化趨勢。
2.5 蘋果發育和成熟過程中代謝物間的相關性
為了研究代謝物在蘋果發育和成熟過程中的相互關係，作者對149種具有代表性的代謝物進行了相關性分析。通過計算Pearson相關係數來評估各代謝物的相關性，149種代表性代謝物之間的相互關係通過圖7中的熱圖顯示出來。如圖7所示，糖與代謝物類別（如核苷酸（放大部分）、幾種有機酸、羥基肉桂醯衍生物、類黃酮等）表現出明顯的負相關，然而，糖醇的相關性相對較少。核苷酸與許多其他次級代謝物類別呈現廣泛的正相關，包括苯甲酸、羥基肉桂醯衍生物（放大部分）、生物鹼、膽鹼、黃酮醇、黃烷酮和兒茶素衍生物（圖7中的箭頭）。琥珀酸、莽草酸、α-酮戊二酸和富馬酸四種有機酸與苯甲酸、羥基肉桂醯衍生物（沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸、香豆酸和香草醛酸）呈顯著相關，此外，這四種有機酸與幾種類黃酮呈高度相關（圖7中的箭頭），而苯甲酸和羥基肉桂醯衍生物與生物鹼、膽鹼（放大部分）和類黃酮（包括黃酮、黃酮醇、黃烷酮、原花青素和兒茶素衍生物）具有高度相關性（圖7中的箭頭）；兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原兒茶醛與柚皮素、根皮素、聖草酚、橙皮苷、原花青素A1等呈高度正相關（圖7）。相關分析為蘋果發育和成熟過程中初級代謝和次級代謝之間的聯繫以及重要的代謝物之間的相關性提供了線索。
圖7 代謝物與代謝物相關性熱圖
從462個代謝物中選取149個具有代表性的代謝物進行相關性分析。採用Pearson算法，利用R軟體評估代謝物相關係數。熱圖的每一平方表示皮爾遜分析得出的相關係數得分，代表代謝物標題行與代謝物標題列之間的相關性。
2.6 不同果實發育階段積累的代謝產物差異
為了研究果實不同發育階段代謝物的顯著變化，作者對PS1與PS2、PS2與PS3、PS3與PS4之間的差異代謝物進行了分析（圖8）。在PS1和PS2之間共鑑定出111種顯著的差異代謝物，其中25種上調代謝物和86種下調代謝物（圖8A）。對於PS2和PS3，29種代謝物顯著上調，90種代謝物下調。這些結果表明，從果實早期PS1到果實膨大期PS2，大部分差異代謝產物均下調，而PS3與PS4之間的差異代謝物顯示出許多上調代謝物（83種上調代謝物和18種下調代謝物），表明在果實成熟期PS4積累了大量代謝物（圖8a），這三種組合中不同代謝物的熱圖也清楚地顯示了上述變化趨勢（圖8C）。此外，如圖8B所示，這三種組合共有19種差異代謝物。PS1與PS2、PS2與PS3共有45種差異代謝物，而PS2與PS3、PS3與PS4有47種共同的差異代謝物。
圖8 果實不同發育階段的代謝物差異積累
(A)PS1與PS2、PS2與PS3、PS3與PS4果實發育階段代謝物積累差異的火山圖；(B)PS1與PS2、PS2與PS3、PS3與PS4之間代謝產物差異的Venn圖；(C)PS1與PS2、PS2與PS3、PS3與PS4之間代謝產物差異的熱圖。每個階段的三個獨立重複也顯示在熱圖中。(D)PS1 vs PS2，PS2 vs PS3，PS3 vs PS4之間差異代謝物的KEGG通路分配：圓點顏色代表p值，圓點大小代表差異代謝物的數量。PS1、2、3和4分別代表花後27、84、125和165天的果實發育階段。
此外，為了研究差異代謝物的相關生物學過程，作者進行了KEGG途徑分析。如圖8D所示，PS1與PS2的差異代謝物顯著參與類黃酮生物合成、苯丙酸生物合成、異黃酮生物合成等，對於PS2和PS3，差異代謝物分為苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等；然而，PS3與PS4的差異代謝物參與異黃酮生物合成、蛋白質消化吸收等（圖8D）；同時，花青素生物合成的富集與色素積累從PS3到PS4一致。作者將所有差異代謝物映射到KEGG途徑，以發現不同果實發育階段之間類黃酮的變化：所有差異代謝物中有14種被映射到類黃酮生物合成途徑，6種差異代謝物被映射到苯丙素生物合成途徑。與PS1相比，PS2中類黃酮和苯丙酸生物合成途徑上的20種代謝物的含量都有所下降，表現為果實膨大過程中類黃酮和苯丙酸的合成受到抑制。在PS2 vs PS3中，7種差異代謝物被定位到苯丙素生物合成途徑，5種被定位到類黃酮生物合成途徑。除對香豆醇外，這13種差異代謝物在PS3中的含量均下降。在PS4和PS3中，只有5種代謝物被映射到苯丙素生物合成途徑。
2.7 與初級和次級代謝相關的基因表達模式-基因和代謝物聯合分析
為了進一步研究轉錄因子在蘋果發育和成熟過程中的調控作用，我們對同樣的4個發育階段的果實樣品進行了轉錄組分析。為了探討蘋果發育過程中代謝變化的轉錄調控作者將不同發育階段的差異表達基因（DEGs）分配到代謝途徑中，如圖9所示，紅色或藍色方框表明，在果實發育過程中，代謝物的含量在增加或降低。小正方形表示相應路徑中涉及的差異基因，正方形顏色表示差異基因的倍數（紅色上調，藍色下調），方框「1」、「2」和「3」上方的數字分別表示PS1與PS2、PS2與PS3和PS3與PS4之間的差異基因。
為了探索代謝組和轉錄組之間的潛在聯繫作者進一步研究了被指定為初級代謝和類黃酮途徑的差異基因（圖9）。結合轉錄組數據，PS1和PS2在代謝途徑中的差異基因最多，並且有大量的差異基因被下調，這與PS1之後代謝物含量的大幅度下降相一致；然而，參與初級代謝的大多數差異基因在PS2 vs PS1中上調（圖9）。果實早期基因表達的增強和初級代謝產物為果實發育過程中的代謝通道提供了前體物質。如圖9所示，參與TCA循環和胺基酸代謝的基因在果實發育過程中被激活，主要在PS1與PS2和PS2與PS3組合中，而代謝組學數據顯示，在果實發育過程中，TCA循環的中間產物，如蘋果酸、延胡索酸和琥珀酸的含量明顯降低，這意味著參與TCA循環的基因被激活，但相應的代謝物被作為下遊代謝的底物被消耗。對於PS2和PS3（果實膨大期），儘管與PS1和PS2相比，分配給初級代謝的差異基因數量減少，但大多數差異基因上調（圖9），這表明，參與初級代謝的基因轉錄本隨著蘋果的膨大而被激活。在色素沉積期（PS3 vs.PS4），不同代謝途徑中有限的基因發生了變化，表明有助於代謝譜建立的基因表達在PS3（預成熟期）完成，在PS4時穩定，而在PS1和PS2中，參與類黃酮途徑的大多數基因都明顯下調，尤其是一些關鍵的控制基因：CHS（查爾酮合成酶基因）、F3H（黃烷酮3-羥化酶基因）等（圖9）。類黃酮基因的下調可能是導致類黃酮含量降低的原因之一（圖5），有趣的是，F3oGT（UDP葡萄糖黃酮類3-O-葡萄糖基轉移酶）的mRNA豐度在PS1 vs PS2中呈現明顯的下調，而F3oGT在PS2和PS3中顯著上調（圖9）。考慮到在代謝物積累之前的基因激活，在PS3（著色前）F3oGT的上調可能是著色期PS4果實色素積累的原因，此外，與差異代謝物相關的PS2與PS1之間的差異基因被映射到KEGG途徑。結果還表明，PS2與PS1中參與類黃酮和苯丙素生物合成的差異基因大部分下調，與代謝產物的變化趨勢一致。
每個代謝物周圍的紅框或藍框表明在果實發育過程中代謝物水平的增加或減少。每個正方形代表參與相應通路的差異表達基因(DEGs)。方形顏色表示DEGs的倍數變化(紅色表示上調，藍色表示下調)。數字1、2和3分別代表PS1與PS2、PS2與PS3、PS3與PS4的差異。初級代謝中的紅色和藍色三角形分別代表胺基酸的合成和催化。PS1、2、3和4分別代表花後27、84、125和165天的果實發育階段。在果實發育的四個階段中，大多數糖的積累水平都呈上升趨勢，而有機酸則呈現出明顯的下降趨勢。許多類黃酮在果實發育初期含量相對較高，在隨後的發育階段迅速降低。相關性分析突出了水果發育和成熟過程中初級和次級代謝之間的相互聯繫，表明糖和次級代謝物之間存在顯著的負相關，此外，轉錄組分析結果表明，從果實早期到果實成熟期，參與TCA循環的差異表達基因（DEGs）上調，類黃酮途徑調控基因的廣泛下調可能是導致果實類黃酮含量迅速下降的原因。這些數據對果實發育過程中的代謝組學變化進行了全面的分析，為商品蘋果重要品質性狀的分子和代謝基礎提供了更廣泛和更好的理解。