...blot提取蛋白時DTT和PMSF等蛋白酶抑制劑你真的了解嗎?蛋白怎麼...

2020-12-18 騰訊網

做Western blot的小夥伴都清楚，我們提取蛋白要加各種蛋白酶或磷酸酶抑制劑，這些酶的作用和發揮作用最佳濃度你真的了解嗎？下面給大家一一盤點下。

DTT：二硫蘇糖醇，一種很強的還原劑，易被空氣氧化，穩定性較差；但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長它的使用壽命[1]。蛋白質二硫鍵（又稱S S鍵，由2個巰基-SH被氧化而形成）常作為活性中心發揮作用，是保持空間結構的重要官能團。為了確定蛋白質的一級結構，DTT可以將cys上的二硫鍵打開，使之成為線狀多肽鏈，這樣也便於抗體識別並結合特定的位點[2]。對於包埋於蛋白質結構內部的二硫鍵，DTT通常作用較弱，這類二硫鍵的還原需先將蛋白質變性（高溫加熱或加入變性劑，如鹽酸胍、尿素或SDS）[3]。DTT在離子狀態下才有作用，pH7-9.5時作用最強，pH降至3以下可終止其作用。PCR反應體系中加入DTT可以使蛋白質從DNA上釋放出來，便於DNA和引物的結合，提高擴增效率。

使用濃度：DTT濃度太低起不到保護作用，濃度太高又會破壞結構。建議在0.5mM~1.5mM之間。有的抗體說明書會給出目的蛋白的最佳使用濃度。

PMSF：苯甲基磺醯氟。是一種絲氨酸蛋白酶不可逆抑制劑。難溶於水，且在水溶液中非常不穩定，容易分解，30min就會降解一半，因此提取蛋白時每一步都要加入新鮮的PMSF，樣品處理超過1h，補加一次。PMSF可溶於異丙醇、乙醇、甲醇、二甲苯和石油醚。有劇毒和腐蝕性。可抑制絲氨酸蛋白酶（胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶），也可抑制半胱氨酸蛋白酶和乙醯膽鹼酯酶[1]。室溫下可保存一年。

使用濃度：0.1~1mM

NaF氟化鈉：溶於水（溶解度10°C 3.66、20°C 4.06、30°C 4.22、40°C 4.4、60°C 4.68、80°C 4.89、100°C5.08）、氫氟酸，微溶於醇，有毒[1]。酸性磷酸酶可逆抑制劑，可抑制絲氨酸、蘇氨酸磷酸酶，對鹼性磷酸酶的效果較差，釩酸鈉才能有效抑制[4]。

使用濃度：10~20mM

焦磷酸鈉：溶於水，不溶於乙醇和其他有機溶劑。與Cu2+、Fe2+、Mn2+等金屬離子絡合能力強[1]。是絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶不可逆抑制劑。

使用濃度：1~2mM

正釩酸鈉：正釩酸鈉與釩酸鈉為同一物質，化學式為Na3VO4，極易溶於水，溶液呈鹼性，不溶於醇[1]。購買過來的一般是原釩酸鈉，需要經過處理，使之變成單體才有效。磷酸酯酶抑制劑，可以抑制鹼性、酸性磷酸酯酶，蛋白酪氨酸磷酸酯酶等磷酸酯酶，可逆抑制劑，也可以抑制Na+/K+ ATPase等ATPase。常用於抑制蛋白去磷酸化或促進蛋白的磷酸化激活，在提取細胞或組織蛋白時常用於保持蛋白的磷酸化狀態[5]。

使用濃度：1mM

β-甘油磷酸(β-glycerophosphate)：是絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶可逆抑制劑。

使用濃度：1mM

通常在提取到蛋白之後，還需要經過煮蛋白這一步，可能會有小夥伴奇怪了，為啥要「煮」蛋白呢？其實這是為了讓SDS和蛋白充分結合，是蛋白質完全變性並解聚，形成棒狀結構並帶上負電荷，從而可以在電場中移動；SDS還能斷開氫鍵，破壞二級和三級結構，使得蛋白質的電泳速度只跟分子量的大小有關。通常煮蛋白的條件是100℃，5min。但有一種特殊的需要用37℃孵育1h，或者60℃30min代替boiling5min，詳情可以戳這篇推文：「師兄，help! help!我的蛋白為什麼一直檢測不出來！」有的小夥伴也可能奇怪了，如果我煮蛋白時間過長過短會怎樣呢？時間過短就不必細說了，肯定是反應不完全，如果一不小心煮蛋白時間過長，樣品會蒸發很多，如果蓋子崩開蒸發會更多，直接導致的一個後果是蛋白濃度定量不準確，其實筆者也挺好奇蛋白煮久了還有哪些其他後果。對於一些濃度大的蛋白樣品可適當延長煮蛋白時間。

另外，煮蛋白後還可能會出現結塊的現象，這種現象可能是由於蛋白樣品濃度過高，已經超出了SDS可以結合的濃度，將樣品稀釋即可。

參考材料：

【1】百度百科

【2】https://wenku.baidu.com/view/b922554af7ec4afe04a1dfe8.html

【3】http://blog.sina.com.cn/s/blog_e4dda7bf0102x1jx.html

【4】丁香園

【5】https://china.guidechem.com/trade/pdetail10865209.html

【6】Vigushin DM et al. Trichostatin A is a histone deacetylase inhibitorwith potent antitumor activity against breast cancer in vivo. Clin Cancer Res.2001 Apr;7(4):971-6.

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