神經網絡交錯縱橫，其複雜的結構以及信號傳遞構築了動物行為和感官的基礎。將相互連接的神經系統作為一個整體來研究，是理解其原理必不可少的一部。當下，螢光成像可以說已成為了主流的觀測神經網絡的方法：螢光蛋白可用來標記特定的神經組織，展示其結構；螢光探針可將生物信號比如鈣離子濃度轉化為光學信號，展示其動態。通過螢光蛋白，光學成像可以同時檢測上百甚至上千個神經元，於此同時，將信號歸納到其中各個神經元也成了既必要也棘手的一部。造成該一步驟苦難的一個主要原因是神經細胞本身複雜的結構，每一個神經元包含了胞體 (soma)和神經突(neural processes) 兩個部分。這一特徵導致了神經元胞體常常被掩埋在其他神經的神經突之中，使得個體間難分彼此，異源的光學信號之間也因此而互相干擾。
多種方式已被提出和發展以解決該問題。比如更精密的光學儀器諸如雙光子成像憑藉更緊湊的點擴散函數可以大致區分胞體和周圍組織間的界限。但精度的提高常常伴隨著速度上的犧牲，同時細小神經組織間的幹擾也並非提高成像精度便能完全解決。從計算層面上，以非負矩陣分解(NMF)來將神經影像拆分成個體間的總和在很大程度上消減了重疊信號之間的幹擾。可是此類計算函數中的假設和不確定性會因實驗條件和測量對象而異，得出的結果也通常無法直接得到考證以致造成潛在的過度補償和人工噪音。
既然這個信號分解的問題出在神經突中螢光蛋白與胞體螢光蛋白間的幹擾，那麼將信號從神經突消除應該便是最直截了當的方法了。比如，利用核定位序列 (nls) 來將螢光蛋白轉移到細胞核內便能讓各個神經元界限分明。但由於核內鈣離子信號與細胞電信號耦合不佳（測量神經元時，鈣離子成像通常是用來推測電信號），該技術會使鈣離子傳感器GCaMP的時間精度顯著降低。
2020年6月22日，UCSF的Zachary Knight組和Buck Institute的Jennifer Garrison組聯手合作（第一作者為陳一茗博士）在Neuron雜誌上發表了題為Soma-Targeted Imaging of Neural Circuits by Ribosome Tethering的文章，利用了核糖體的特性，展示了一種可將螢光蛋白定位在胞體內並且保留其精度的方法。
一 螢光蛋白的信號可由核糖標記來進行高度聚集和提升
在博士後階段，Zack曾做了一株Nano-L10轉基因小鼠。該鼠體內的核糖體亞基L10由GFP的單域抗體Nanobody所標記，通過單域抗體，GFP會通過L10聚集到核糖體上。在Knight實驗室建立的初期，該技術的應用主要聚焦在提取核糖體來以及核糖體上的mRNA來對特定細胞進行深度測序(translating ribosome affinity purification, TRAP)。隨著研究的進展，Knight組觀察到了這些連接在核糖體的GFP總是位於神經元的胞體內，並且大概由於聚集的原因，總是使得細胞非常的明亮。逐漸大家開始用核糖體連接的螢光蛋白來分析對象細胞的分布以及數量。該文章的開頭展現了這一個過程並且測試了各種不同神經組織內該方法的適用性。尤其值得關注的一點是，在過去產生的上百種標記細胞或蛋白的GFP轉基因小鼠中，大多數GFP信號的微弱得若有若無的，而當這些GFP被Nano-L10聚集後，信號得到了顯著的加強，使得這些轉基因株能被更廣泛的應用，也避免了因為信號的若有若無而誤讀GFP細胞本身的分布。
二 核糖標記可將GCaMP限制於胞體內
之後，作者猜想，也許這一核糖體標記(ribo-tagging)方式也適用於GCaMP以提升鈣離子成像的質量。若能將所有GCaMP限制於胞體內，那將是一個對神經生物領域中光學測量手段非常有意義的提升。於是作者將GCaMP和核糖體亞基L10直接進行了連接克隆了ribo-GCaMP。經過測試，作者發現在大腦皮層(cortex)，下丘腦(hypothalamus)，海馬體 (hippocampus)，上丘(superior colliculus)中， 核糖標記都能將神經突中GCaMP大幅減弱，幾近消除。通過高精度的雙光子掃描成像，作者對比了核糖標記的ribo-GCaMP和普通GCaMP在神經元不同部位報告動作電位的效率。該實驗發現，在胞體內，ribo-GCaMP和普通GCaMP的信號旗鼓相當。而當在測量位點離開胞體後，ribo-GCaMP的信號立即變得微乎其微，而普通GCaMP在神經元的不同部位都有大致相同的信號強度。為了進一步證實核糖標記對GCaMP的精度無損，通過高通量的場電流刺激加單光子錄影。以及膜片鉗加雙光子成像，作者發現ribo-GCaMP和GCaMP在不同條件下都有相似的敏感度，時間精度以及信噪比。
三 Ribo-GCaMP可用於小鼠活體鈣離子成像並減少信號噪音
那麼，在領域內常見的光學機器下，ribo-GCaMP是否能展示出其優勢呢？在小鼠內，作者以神經生物學常用的雙光子成像和微型顯微鏡加梯度折射透濾鏡(GRIN lenses)測試了ribo-GCaMP的表現。在視覺皮層內，作者驚訝地發現即便是雙光子成像也遭受這嚴重的信號源相互汙染。具體體現是，在通過GCaMP收集的數據中，當神經元之間離得越近，其信號之間的相關係數(correlation coefficient)就越高 - 這十分可能是因為神經元之間通過神經突造成的重疊。而當用ribo-GCaMP在相同實驗條件下收集數據後，該距離與相關係數的偶聯幾乎盡數消失（除了50微米間距以內）。由此可見，將GCaMP從神經突消除還是對數據的質量很有提升的。而當作者用單光子的微型顯微鏡通過梯度折射濾鏡觀察內側前額葉皮層（mPFC）時，該提升就變得非常的不顯著了。作者認為這是因為在該實驗條件下，主要的信號汙染來自光的散射以及聚焦外光源的幹擾，而將螢光限制於胞體內並無法有效改善這些光學層面上的不足。最後，作者在兩個實驗內發現，核糖標記會讓GCaMP的亮度降低，比如雙光子顯微鏡下需用大約2.4倍的雷射強度才能達到大概一致的亮度。目前該缺陷還未得到解決的方法，原因可能是由於核糖體數量的限制，也可能是因為核糖體分布於鈣離子濃度較低的部位。
活體成像非常重要的一點是所表達螢光蛋白的毒性。通過免疫染色，細胞膜特性測量，以及活體內微型顯微鏡(miniscope)三種方法觀察了腦組織在表達ribo-GCaMP和普通GCaMP數周以至數月以後的變化。作者並未發現兩者在細胞毒性上有任何本質上的區別。綜上所述，核糖標記是一種在不改變GCaMP毒性以及活性情況下能有效將其限制在胞體內的方法。
四 Ribo-GCaMP可提升線蟲全腦鈣離子成像
除了小鼠外，線蟲也是神經生物常用的模式生物。作者於是做了表達ribo-GCaMP的線蟲來測試該技術是否可以提升線蟲內的鈣離子成像。由於線蟲的頭部微笑，一個顯微視野便可以輕易地記錄整個頭部所有神經元的活動。在過去該成像技術依賴於帶有核定定位序列的GCaMP（nls-GCaMP）來將各個神經元從錯綜複雜的神經網絡中區分出來。若ribo-GCaMP可以在不犧牲時間精度的情況下做到相同的效果，那麼將是一個很好的技術提升。經過測試，相比普通GCaMP, ribo-GCaMP可消除神經元之間信號的汙染並且允許全腦，單神經元解析度的鈣離子成像。相比nls-GCaMP, ribo-GCaMP大幅提升了鈣離子成像的時間精度，並且能呈現出很多會被nls-GCaMP漏過的神經活動。與小鼠內測試不同的是，ribo-GCaMP在線蟲內還保留了普通GCaMP的亮度。
在這篇文章中，作者展示了一個易於使用並且能高效清除細胞突信號幹擾的技術。通過將可溶的螢光蛋白間接抑或直接連接在核糖體上，作者將信號固定在了胞體內。當然，其他位點也可以用來以胞體為靶向的固定，比如鉀離子通道2.1(Kv2.1)的模體(motif)，錨定蛋白(ankyrin)，可減緩蛋白運輸的模體，以及kainate受體亞基2都可將蛋白或多或少地固定於胞體周圍。
回思發展和測試該技術的過程，作者認為核糖體相較之下有幾個不同之處，使得其一部分特性尤其適用於固定可溶蛋白。首先，不同於膜蛋白，核糖體本身是可溶的，因此大致保證了周圍是水環境以及受牽制蛋白的活性和摺疊。然後，核糖體本身在關於其眾多的研究中，並未發現與鈣離子有重要的交互，這也許解釋了為什麼連接GCaMP到核糖體上並無細胞毒性。同時，作為數量最多的細胞器，核糖體能夠提供大量的固定位點，保證了受牽制的蛋白可以有一定地數量來產生效果。最後，核糖體蛋白作為進化上非常悠久且重要的細胞部件，有著一套緊密的調控機制。比如，那些並未能完全整合於核糖體中的核糖蛋白會被分解。這一機制保證了單個細胞表達量的穩定，也避免了一些本該被固定的蛋白遊走到細胞突內造成幹擾的情況。在未來，科學家可以嘗試將核糖標記運用到其他可溶蛋白上來將其固定於胞體的細胞質內。綜合來看，這篇文章以及其他相同方向的努力使得生物光學成像的數據質量得到了近一步地提升。希望我們在未來可以看得更多，更精，更真實。
作者：Bioart
原文連結：
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2020.05.005