生物標記三部曲:綠色螢光蛋白、辣根過氧化物酶和小型單線態氧製造者

2020-12-11 生物谷

生物標記三部曲：綠色螢光蛋白(GFP)、辣根過氧化物酶(HRP)和小型單線態氧製造者(MiniSOG)

【towersimper註：本文為譯文，每篇都有部分改動，僅用作研究之用，不得用作商業開發，轉載請標明翻譯者towersimper，第一篇來自Sowmya Swaminathan, Nature Cell Biology, "GFP: the green revolution", doi:10.1038/ncb1953, October 1, 2009；

第二篇來自Andy, brainslab.wordpress.com,"Horseradish peroxidase as marker for anatomical em", April 3, 2011；

第三篇來自Andy, brainslab.wordpress.com, "MiniSOG, a light and electron microscopy fusable marker", April 16, 2011】

第一篇：綠色螢光蛋白: 綠色革命


來自秀麗隱杆線蟲(Caenorhabditis elegans)的兩個觸覺感受器神經元的細胞體(cell body)用編碼β-微管蛋白的基因表達的綠色螢光蛋白標記，圖片來自doi:10.1126/science.8303295.

1994年，Chalfie等人在Science雜誌發表一篇報導，表明來自維多利亞水母(Aequorea Victoria)的綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)，在沒有任何A. Victoria的輔助因子存在下，能在活著的細菌和線蟲細胞中用作蛋白定位和表達的標記。這種顯示GFP作為體內研究蛋白的工具基本上改變了細胞生物學家能夠解決的問題的性質和範圍。

1962年，Shimomura和他的同事們在A. victoria生物發光蛋白水母素(aequorin)的純化過程中偶然間第一次發現了GFP。1974年，Morise和他的同事們在隨後的純化、晶體形成和從水母素到GFP能量轉移的體外重建過程中，為GFP的螢光性質提供啟迪，而且證實GFP接受來自水母素的能量轉移後發射綠光。

在此之後許多年，在外源系統中GFP是否需要水母素和可能來自水母的其他因子發出螢光，這仍然是一個公開的問題。1992年，也就是在GFP發現後的30年，Prasher等人克隆了編碼GFP的基因，就為實驗上評估它用作蛋白質的體內標記鋪平道路。而在兩年後，Chalfie等人證實當GFP在細菌和線蟲細胞中表達時，它能夠發出螢光。在線蟲中，GFP是在一個表達β-微管蛋白的基因啟動子的控制下表達的。它在線蟲特異性神經元中的時空表達模擬了內源性β-微管蛋白基因的表達，因而證明GFP能夠作為一種可靠的標記以便監控基因表達模式。此後不久，Roger Tsien的實驗室對天然GFP進行改造使之變得更加明亮和耐光，以及在一個與常規顯微鏡過濾器裝置相匹配的波長下激發，因而增加了它的實際適應性。GFP技術的下一個突破便是開發GFP變異體產生藍色、青色和黃色螢光蛋白，因而能夠使得影像實驗在細胞和有機體中採用多種標記的蛋白。

綠色螢光蛋白(GFP)是由238個胺基酸殘基組成，在藍色波長範圍的光線激發下，會發出綠色螢光。而EGFP是增強型的GFP (enhanced GFP)，發生了雙胺基酸取代，亮氨酸(Leu)取代GFP上第64位苯丙氨酸(Phe)，蘇氨酸(Thr)取代了GFP上的第65位絲氨酸(Ser)，與GFP相比，具有更強更穩定的綠色螢光。黃色螢光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)其序列與GFP基本相同，不同之處就是把第203位Thr以Tyr取代，這樣的GFP不發出綠色螢光，而發出較長波長的黃色螢光。青色螢光蛋白(cyan fluorescent protein, CFP)與此類似，也是GFP第66位Tyr(酪氨酸)被Thr(色氨酸)所取代的結果，發青色螢光。由此可見，GFP標籤與其它突變體GFP、YFP、EYFP、CFP的序列非常的類似，只有1-2個胺基酸殘基的變化。

在GFP發現後的將近半個世紀以來，因為發現和開發綠色螢光蛋白，2008年諾貝爾化學獎被授予給Osamu Shimomura, Martin Chalfie和Roger Tsien，來表彰這次發現給後世帶來的巨大影響。

參考文獻：

Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W. & Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263, 802–805 (1994).

Shimomura, O., Johnson, F. H. & Saiga, Y., Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 59, 223–239 (1962).

Morise, H., Shimomura, O., Johnson, F. H. & Winant, J. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea. Biochemistry 13, 2656–2662 (1974).

Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G. & Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 111, 229–233 (1992).

Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509–544 (1998).

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第二篇：辣根過氧化物酶作為解剖學電子顯微鏡(anatomical electron microscopy)的標記

要繪製諸如視網膜的大容量組織中的突觸聯繫(synaptic connection) James R. Anderson等人於2009年就已經主張應當將分子表達譜(molecular profiling)與電子顯微鏡圖片相關聯。

如今，這裡給出一個例子來說明分子表達譜儀(molecular profiler)如何得到很好的利用。Jianli Li等人[1]採用電穿孔技術產生將攜帶有靶向到細胞膜的辣根過氧化物酶(membrane-targeted horseradish peroxidase, mHRP)基因的表達構建物導入神經元。辣根過氧化物酶發射可放大的波長為428nm的螢光。這些研究人員就使用它作為解剖學上的標記，與蝌蚪神經元的連續切片電子顯微鏡圖片(serial section electron microscopy, SCEM)在空間上相互關聯。

辣根過氧化物酶的優勢之一在於它在包括線粒體/小泡(vesicle)在內的細胞膜上均勻分布。它也有助於鑑定長軸突(axon)/小直徑的樹突(dendrite)。但是另一方面，不同於其他的標記，它不得不在動物仍然活著的時候通過電穿孔技術導入細胞才有效果。

下面是一系列電子顯微鏡圖片，其中遠側樹突分支(distal dendritic branch)，藍色顯示；帶有軸突末端(axon terminal, 用粉紅色顯示)的突觸，用白色箭頭符號指示：

比例尺=1微米

當從向右觀看這一系列圖片時，你能夠看到樹突如何縮減，而研究人員能夠在他們的微迴路(microcircuit)模型中重構這些圖片。

為了鑑定突觸，這些研究人員使用了兩種主要策略：

1) 至少進行兩次連續切片，在每次切片中，錨定和成簇突觸小泡與緊鄰神經元的細胞膜相對。

2) 在突觸位點處的前突觸膜(presynaptic membrane)細胞內部分到後突觸膜(postsynaptic membrane)細胞質的距離應當要比非突觸位點處的距離顯著性地長。與這一致的是，在突觸位點處的前突觸膜和突觸間隙(synaptic cleft)電子緻密物(electron dense material)應當要比非突觸位點處的相應物質更加茂密。

下面的圖表量化突觸位點和非突觸位點處的平均膜厚度，儘管在表達辣根過氧化物酶的神經元中這些差異實際略微不是很明顯：

參考文獻：

Li J, Wang Y, Chiu S and Cline HT (2010) Membrane targeted horseradish peroxidase as a marker for correlative fluorescence and electron microscopy studies. Front. Neural Circuits doi:10.3389/neuro.04.006.2010.

第三篇：一種可融合的光學顯微鏡和電子顯微鏡標記：小型單線態氧製造者(MiniSOG)

1994年綠色螢光蛋白在外源系統表達在光學顯微鏡領域引發一場「綠色革命」，允許研究人員在細胞中可視化單個蛋白分子。

在最近的一份研究論文中，Shu et al.首先回顧了試圖為電子顯微鏡生產類似分子，如辣根過氧化物酶，但是他們作出結論，它們全部都有嚴重性的缺點。他們隨後報導了他們構建的一種稱作小型單線態氧製造者(mini singlet oxygen generator, miniSOG)的蛋白分子，它是對來自植物擬南芥天然蛋白向光色素-2(phototropin-2)的一部分進行基因改造而成，能夠非常像從水母中獲得的基因編碼的螢光蛋白家族一樣進行使用，同時也是一種有效的氧氣製造者。這種蛋白的唯一輔因子是黃素單核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)，而FMN是線粒體電子傳遞鏈所必需的，因而幾乎在所有的細胞中存在。

在培養的HeLa細胞中，他們將miniSOG與細胞色素C融合在一起，證實表達這個分子能夠在光學顯微鏡和電子顯微鏡下標記線粒體，如下圖所示：

J = 光氧化之前的共聚焦顯微圖片，K = 光氧化之後的透射光顯微圖片； 箭符號=表達miniSOG的細胞，箭頭符號=不表達miniSOG的細胞；L / M = 電子顯微鏡，注意一下線粒體的外膜、內膜和嵴(cristae)保存完好的形態；圖片來自doi:10.1371/journal.pbio.1001041。

研究人員也將miniSOG與一種SynCAM同工型(isoform)融合在一起，而SynCAM是一種促進突觸組裝的細胞粘附蛋白，預期定位在後突觸。他們然後使用串聯黑體掃描電子顯微鏡(serial block face scanning electron microscopy)觀察小鼠組織來確定標記物miniSOG三維空間中的位置。

唯一問題就是「miniSOG革命」是否如同「綠色革命」這個名字一樣容易讓人記住。

參考文獻：

Shu X, Lev-Ram V, Deerinck TJ, Qi Y, Ramko EB, et al. (2011) A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biol, 9(4): e1001041. doi:10.1371/journal.pbio.1001041

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