Nat Methods|「唯快不破」,冷凍電鏡捕捉蛋白質的瞬間動態過程

2020-12-18 BioArt生物藝術

撰文 | Leon

責編 | 雪月

有了冷凍電鏡（cryo-EM）技術，科學家們可以在溶液中觀察生物大分子的各種構象狀態。蛋白質構象的變化發生於多種生物反應的過程中，如酶遇到了底物、蛋白分子機器的各種成分組裝在一起、以ATP或GTP的形式為蛋白分子機器提供能量等。結合精確控制的噴霧-混合系統，冷凍電鏡可以捕捉到蛋白質樣品非常迅速的（毫秒級）構象變化，這種方法也叫time-resolved cryo-EM【1】。

2020年8月10日，美國哥倫比亞大學的Bridget Carragher課題組在Nature Methods 雜誌發表了題為Time-resolved cryo-EM using Spotiton 的論文，報導了他們開發的Spotiton冷凍電鏡樣品製備系統，可捕捉非常迅速的蛋白質構象變化。

研究者報導了他們開發的噴霧-混合系統Spotiton（圖1）【2，3】。在10毫秒內，兩個噴頭把約50uL的樣品液滴分別灑在網格上。約100毫秒後，網格被浸入液體乙烷，樣品的混合也隨之停止。進一步地，研究人員在四種蛋白樣品（核糖體亞基之間的結合、RNA聚合酶與啟動子的結合、鈣離子與鉀離子通道的結合、動力蛋白dynamin對GTP的水解）中測試了該系統的強大功能。

圖1. Spotiton系統的示意圖，右圖為左圖綠框範圍的放大

加入鈣離子後，鈣門控的鉀離子通道（calcium-gated potassium channel）MthK會在毫秒內激活，並在兩秒內逐漸失活【4，5】。正因為其活化狀態的持續時間非常短，之前的單顆粒冷凍電鏡研究只捕捉到MthK的兩種構象：無鈣離子的關閉狀態和有鈣離子時的失活狀態，而缺少了活化狀態下的MthK結構【6】。這項研究中，實驗人員成功使用Spotiton機器人在約150毫秒內製備了結合鈣離子的MthK樣品，並且收集了冷凍電鏡數據。可以明顯地看到，MthK的跨膜區和配體結合區之間存在明顯的傾斜，而這正是MthK活化的標誌之一（圖2）。

圖2. 鈣離子的結合引發了MthK快速的構象變化

除此以外，作者還用Spotiton聯合單顆粒冷凍電鏡研究了30S和50S核糖體亞基組裝成70S核糖體的過程、大腸桿菌RNA聚合酶結合λPR啟動子的初始狀態、以及動力蛋白對細胞膜進行收縮時的構象變化。

這四個案例代表了持續時間非常短的生物大分子狀態。研究證明，Spotiton系統可以有效混合樣品，並在約100毫秒內快速使樣品玻璃化，捕獲生物反應的中間狀態。這種方法所需的材料非常少，可用於混合任意兩個或多個樣品。天下武功，唯快不破。有了Spotiton系統，科學家們可以觀察到生物分子之間發生初始相互作用後50到500毫秒之間的狀態

參考文獻

1. Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy: recent progress.J. Struct. Biol.200, 303–306 (2017).

2. Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B. & Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM.J. Struct. Biol.179, 68–75 (2012).

3. Dandey, V. P. et al. Spotiton: new features and applications.J. Struct. Biol.202, 161–169 (2018).

4. Zadek, B. & Nimigean, C. M. Calcium-dependent gating of MthK, a prokaryotic potassium channel.J. Gen. Physiol.127, 673–685 (2006).

5. Posson, D. J., Rusinova, R., Andersen, O. S. & Nimigean, C. M. Calcium ions open a selectivity filter gate during activation of the MthK potassium channel.Nat. Commun.6, 8342 (2015).

6. Fan, C. et al. Ball-and-chain inactivation in a calcium-gated potassium channel.Nature580, 288–293 (2020).

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