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8月28日，Nucleic Acids Research
（IF=11.147，中科院JCR 1區）在線發表了Thomas J. Sanford團隊的一篇關於circRNAs研究論文，報導了黃病毒基因組RNA的環化抑制了從頭翻譯起始過程。
簡介
黃病毒，包括登革熱病毒（DENV）和黃熱病病毒，在人類中引起嚴重疾病，而母親感染寨卡病毒（ZIKV）後會誘發新生兒小頭畸形。感染病毒後，黃病毒RNA基因組既要被翻譯產生蛋白，也必須作為新基因組轉錄的模板。翻譯所需的核糖體和轉錄所需的病毒聚合酶沿基因組RNA以相反的反向起始，存在碰撞和複製失敗的風險。雖然黃病毒基因組RNA通常是線性的，但其5』和3』UTR區可以鹼基配對，促使基因組RNA形成環狀，而5』和3』UTR區鹼基配對對於其複製是必需的。本實驗使用體外重建的方法，證明黃病毒ZIKV和DENV基因組RNA的環化抑制其從頭翻譯起始，而線性構象是翻譯能力的。本實驗的結果表明，清除病毒的核糖體可以促進有效地複製，並驗證了黃病毒基因組的線性和環狀構象的相反作用。
ZIKV病毒翻譯起始的體外重建
為了研究黃病毒翻譯的機制，作者在體外重建了ZIKV 基因組RNA的翻譯起始體系。這種方法以前曾用於成功探索細胞戴帽結構依賴性和病毒IRES（核糖體進入位點）依賴性翻譯的機制。通過兔網織紅細胞裂解物或大腸桿菌獲得EIF（真核翻譯起始因子）和小核糖體亞基的純化蛋白。將EIF與體外轉錄的RNA（攜帶ZIKV病毒的 5'UTR和衣殼蛋白前252個核糖核苷酸，ZIKV5'utr+）一起溫育。由於組裝的48S複合物可以阻止逆轉錄酶，導致在起始密碼子下遊15-17nt處產生截短的cDNA產物，因此可以通過引物延伸抑制實驗以測定48S複合物的組裝。該技術的示意圖如圖1B所示。
作者研究了5'戴帽結構對重構系統中ZIKV病毒基因組 RNA翻譯起始效率的影響。在存在完整的標準翻譯起始因子的情況下，當ZIKV5'utr+ RNA未加帽時，可以檢測到非常少的48S複合物形成。RNA的加帽導致在真正的AUG108處形成48S複合物。
作者接下來試圖通過對加帽的ZIKV5'utr+ RNA進行系統的缺失實驗來確定哪些eIF是ZIKV翻譯起始所必需的。eIF2和eIF3的缺失完全抑制了AUG108的翻譯起始，而在沒有eIF4F的情況下會產生非常少的48S複合物，與5'戴帽結構的翻譯一致。無論有沒有可以在1型和2型小核糖核酸病毒核糖體進入位點翻譯起始的eIF4G736-1115片段時，均不能彌補缺失eIF4F的狀況。但是，使用相同的純化蛋白，當僅包含小核糖體亞基，eIF2和Met-tRNAiMet時，就可以檢測到來自豬瘟病毒HCV-like 核糖體進入位點的48S複合物組裝，確認這些蛋白足以起始黃病毒科其他屬病毒的核糖體進入位點的翻譯。缺少eIF1時，ZIKV翻譯起始同樣不能進行。然而，作者觀察到eIF1A的缺失輕微減少了AUG108的起始，但促進了上遊的近同源密碼子的選擇，特別是UUG41和更小程度的UUG86。因此，雖然啟動時絕對需要eIF1，但仍需要eIF1A來保持選擇的準確性。
由於黃病毒5'UTR高度結構化，因此作者研究了RNA解旋酶對ZIKV翻譯起始的影響。除了eIF4F複合物中存在的eIF4A之外，在加帽的ZIKV5'utr+ RNA上進行48S複合物組裝需要額外的eIF4A。同樣，缺失eIF4B（一種eIF4A輔助因子，可以與黃病毒基因組RNA結合）也降低了翻譯起始效率。eIF4A抑制劑hippuristanol也以劑量依賴方式減少48S複合物的組裝。該研究與最近的一項研究ZIKV在A549細胞和原代人肝細胞中的複製被另一種eIF4A抑制劑silvestrol抑制是一致的。
圖1 ZIKV RNA上的48S複合物裝配依賴於戴帽結構
ZIKV複製需要基因組環化
先前已報導DENV和WNV（西尼羅河病毒）病毒複製依賴於完整的5』和3』 UTR RNA-RNA相互作用，但這些對於翻譯是不必要的。因此，作者研究了突變3』環化序列（CS）後對ZIKV病毒複製和翻譯的影響。作者將報告基因Nluc插入到ZIKV基因組RNA中，並突變3』 CS序列，轉入Vero細胞中，並以在病毒聚合酶活性位點突變G664DD為G664AA作為陰性對照，並通過qPCR定量基因組拷貝數，同時測量螢光素酶以監測病毒基因組的翻譯。
所有RNA的基因組拷貝數在電穿孔後6和24 h之間降低，48小時後，WT RNA回升，但ZIKVNluc-GAA突變體不能複製。ZIKVNluc-Δ3'CS突變體RNA與ZIKVNluc-GAA突變體一樣，轉入細胞後ZIKV不能進行複製，表明ZIKV病毒複製需要完整的5'-3'環化序列的相互作用。病毒基因組的翻譯與RNA複製的動力學一致。重要的是，轉入細胞6 h後，此時轉入WT RNA、ZIKVNluc-GAA和ZIKVNluc-Δ3'CS細胞中ZIKV的基因組拷貝數是一致的，並且這三種細胞中螢光素酶的量相似，表明WT和Δ3'CS突變體在該實驗系統中RNA以相同的效率翻譯。
圖2 ZIKV複製需要基因組環化
環化抑制ZIKV從頭翻譯起始
最近的一項研究表明，通過RNA結構分析，感染期間細胞中大多數ZIKV基因組RNA是線性的，對於在細胞中檢測基因組環化對翻譯的影響是不利的。為了克服這個問題，作者使用體外重建技術直接比較受控系統中線性和環狀模板的翻譯。作者首先進行體外轉錄，並為缺乏衣殼複製或Nluc報告基因的WT全長ZIKV基因組RNA（ZIKVfl）加帽。由於該RNA含有完整的5'和3'UTR，作者假設它們可以配對並提供合適的模板用於評估環化對翻譯起始的影響。為了確定是否是這種情況，作者使用SHAPE（selective 2'-hydroxyl acylation and profiling experiment）分析RNA結構。
SHAPE分析顯示體外轉錄的ZIKVfl RNA採用線性構象。作者假設減少UTR的~10kb可能增加環化的可能性。因此，作者構建了ZIKV小基因組（ZIKVmini），其在未改變的5』和3』個UTR中間加上60 nt的接頭。以ZIKVmini為背景，構建了突變體，如圖所示。首先通過天然PAGE檢查ZIKVmini的構象。環狀RNA的結構更緊湊，因此比線性RNA遷移更快。一致地，ZIKVmini- 3 』CS和ZIKVmini-5』CS比WT ZIKVmini遷移慢。而ZIKVmini-CS/Swap與WT遷移速度一樣，表示，ZIKVmini- 3』 CS和ZIKVmini-5』 CS RNA為線性的，ZIKVmini-CS/SwapRNA中有鹼基配對。
隨後，通過SHAPE進一步分析了ZIKVmini RNA的結構，發現WT ZIKVmini的5』CS區核苷酸中具有非常低的反應性，而ZIKVmini-Δ3』CS中的5』CS區的核苷酸是高度反應性的，表明WT ZIKVmini RNA存在鹼基配對，而ZIKVmini-Δ3』CS中不存在鹼基配對。在ZIKVmini-CS/Swap的5』CS區內，核苷酸顯示出與WT ZIKVmini類似的降低的反應性，表明交換5』和3』CS元件恢復鹼基配對。結合PAGE和SHAPE兩個實驗結果表明，WT ZIKVmini 和ZIKVmini-CS/Swap是鹼基配對的，而ZIKVmini-Δ3』CS是線性的。
作者接下來在加帽的ZIKVmini RNA上進行體外重建。與WT ZIKVfl RNA相反，在WT ZIKVmini的起始AUG108處檢測到少的48S複合物組裝。5』或3』CS元件的突變（RNA不能環化），增加了該位點的48S複合物的形成，同時ZIKVmini-CS/Swap（5』CS和3』CS交換，可以環化）中AUG108處也檢測到較少的48S複合物組裝，表明對翻譯起始的影響不是由於突變，而是由於基因組環化。與CS區突變類似，5』或3』UAR序列的突變也刺激了48S複合物的形成，而5』-3』 UAR交換再次逆轉了這種影響。
圖3 ZIKVmini RNA被環化
圖4 ZIKV基因組環化抑制翻譯起始
基因組環化損害了翻譯起始的掃描過程
有趣的是，雖然ZIKV RNA環化在AUG108減少了48S複合物組裝，但兩個上遊近同源密碼子（UUG41和UUG80）的48S複合物組裝得到增強，表明環化的ZIKV RNA導致翻譯過程中的掃描紊亂。
作者接下來檢查了在環化WT ZIKVmini的背景下突變UUG41和/或UUG80的影響。引入的突變顯示在圖4D中。UUG80突變為UCC，而UUG41被UUU取代，具有補償性C21A突變以維持SLA中的鹼基配對。引入的突變消除了UUG41和UUG80處的48S複合物組裝。有趣的是，UUG41和UUG80的同時突變在AUG108沒有增強48S複合物組裝，而是選擇了UAR的5'前緣的UUG86。這些數據表明UUG41或UUG80的起始並沒有嚴格抑制環化RNA構像中AUG108處的 48S複合物的組裝，單獨的RNA結構就足以介導這種現象。
基因組環化還抑制DENV中的從頭翻譯起始
由於環化是所有黃病毒的共同特徵，所以作者研究了環化是否也影響DENV的翻譯起始。作者檢測了DENV1或DENV4的5』和3』UTR的mini基因組RNA的48S複合物組裝。作者用與ZIKVmini RNA的方法相似的方法，通過突變3』 CS或添加與3』環化元件互補的短ASO來破壞基因組環化。與ZIKV一樣，環化抑制DENV1mini和DENV4mini基因組RNA的從頭翻譯起始，而環化的破壞增強了真實起始AUG上的48S複合物形成（DENV1中的AUG95和DENV4中的AUG102。與ZIKV一樣，觀察到DENV RNA的上遊UUG48的增強選擇，與環化形式的掃描缺陷一致。總的來說，作者的數據表明基因組環化是不同的黃病毒用於控制基因組使用的保守機制。
圖5 環化抑制DENV基因組RNA的翻譯起始
參考文獻
1.Sanford, T. J., Mears, H. V., Fajardo, T., Locker, N., Sweeney, T. R. (2019). Circularization of flavivirus genomic RNA inhibits de novo translation initiation. Nucleic Acids Research. DOI: 10.1093/nar/gkz686
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