信息來源：姚貴哲等中國動物檢疫
摘要：弓形蟲病（toxoplasmosis）是一種由弓形蟲引起的嚴重危害人類及動物健康的人獸共患原蟲病。目前沒有理想的治療藥物，早期確診是有效的防控手段之一。本文從病原學、免疫學、分子生物學角度，總結了各診斷方法的優缺點。病原學檢測雖然操作簡便，但不適於大規模檢測，而且費時費力，靈敏度低；免疫學檢測方法操作簡便、特異性和敏感性強，其中ELISA方法是最常用的一種檢測方法；分子生物學檢測雖然準確性、靈敏度、特異性較高，但大多操作比較繁瑣，需要特殊的儀器設備。提出未來研究方向是研製適於大量樣品檢測以及流行病學調查的商品化ELISA方法試劑盒，以及可直接對多種組織中弓形蟲病原進行檢測的商品化分子生物學試劑盒。
弓形蟲病（toxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplsma gondii）引起的呈世界性分布的嚴重危害人類健康和畜牧業發展的人獸共患寄生蟲病。弓形蟲主要寄生在細胞內部，人類通過進食未煮熟的含有弓形蟲卵囊的食物或者被汙染的水源而感染。健康人群感染後無明顯的臨床症狀，但是免疫功能低下的人群感染後則會引起嚴重的後果：孕婦感染後會導致流產，產弱胎、畸胎、死胎等；器官移植的病人，由於免疫抑制劑的使用導致機體免疫功能下降，感染後病原會在多個器官迅速增殖，導致機體功能衰退。弓形蟲感染是愛滋病患者中常見的機會性感染，感染引起的免疫抑制使潛伏感染再激活導致嚴重的甚至可能致命的腦炎。弓形蟲病不僅對人類的健康存在著威脅，也給畜牧產業帶來了巨大的經濟損失。2004年，弓形蟲病曾在我國的豬場大肆流行，死亡率高達60%，嚴重影響了當時的養豬產業。不僅如此，此病會使懷孕動物出現流產、產死胎，還會使患病動物死亡，對動物健康造成了極大威脅。該病目前無有效治療藥物，早期確診是有效的控制手段之一。本文從病原學、免疫學和分子生物學方面，綜述了各診斷技術的研究進展以期為疫病診斷方法的選擇提供參考。
病原學診斷
目前常用的弓形蟲病檢測方法為顯微鏡鏡檢和動物接種。顯微鏡鏡檢是選取樣本的病變部位或者將糞便和水中的卵囊過濾之後塗片、固定並使用吉姆薩染色和HE染色方法對包囊染色，最後觀察結果。Khademvatan等通過顯微鏡對伊朗的多隻齧齒動物塗片進行了弓形蟲病檢測，結果有1例感染了弓形蟲病；利用PCR方法檢測出弓形蟲陽性樣品41份；血清學方法檢測弓形蟲抗體陽性率與PCR方法檢測結果相近。這說明鏡檢方法雖然可直接觀察到病原，但檢出率較低，不適合作為單一方法用於檢測弓形蟲病原。除此之外，動物接種法也常應用於弓形蟲診斷，該方法將病料接種至易感動物體內或通過細胞培養等方式對弓形蟲進行檢測。孫新利用小鼠腹腔接種和THP21細胞培養的方法，對30頭孕鼠的羊水進行弓形蟲分離鑑定，共分離得到6株弓形蟲，細胞培養組平均陽性時間8d，而接種組平均陽性時間為9周，檢測所需時間都較長。病原學診斷方法雖然操作簡便，但步驟繁瑣，耗時長，靈敏度低等，無法滿足高效、快速的檢測需求，因此在實驗室診斷方面應用較少。
免疫學診斷
免疫學診斷方法常被應用於弓形蟲病檢測，包括染色試驗（sabin-feldman dye test，DT）、凝集試驗和酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等。
染色試驗（DT）
染色試驗於1948年首次創立，只適用於弓形蟲感染，特異性較強。染色試驗是通過弓形蟲分別與陰性和陽性血清作用後，根據鹼性美藍液染色結果判斷被檢體內是否含有弓形蟲抗體。趙恆梅等通過該方法對11份陽性兔血清和34份弓形蟲病人的血清進行檢測，發現陽性率分別為100%和94.1%，並與血吸蟲病、肺吸蟲病、瘧疾等均無交叉反應。染色試驗由於其特異性強、敏感性高等優勢曾被稱為最有價值的檢測方法，在早期的診斷中被廣泛使用。但此方法使用的抗原必須為活體，且不利於操作，存在著巨大的危險性，因此被限制使用。
凝集試驗
凝集試驗主要包括直接凝集試驗（direct agglutination test，DAT）、間接血凝試驗（indirect hem agglutination test，IHA）、乳膠凝集試驗（latex agglutination test，LAT）、改良凝集試驗（mend agglutination test，MAT）。
直接凝集試驗（DAT）。直接凝集試驗是用甲醛固定弓形蟲懸液來作為抗原，與被檢血清直接進行反應。在載玻片加入稀釋度不同的試驗血清，混勻，幾分鐘後在顯微鏡下觀察，如果發生凝集現象，則證明為陽性，反之為陰性。1991年，張述義等通過微孔板法建立了檢測弓形蟲IgG抗體的直接凝集試驗，通過這種方法能檢測出早期感染的IgG抗體。
間接血凝試驗（IHA）。間接血凝試驗是利用弓形蟲可溶性抗原致敏於紅細胞表面，當其與相應的抗體產生反應時，可以用肉眼觀察到凝集現象。間接血凝試驗比直接凝集試驗靈敏性高，特異性強，因而常用該方法進行流行病調查。但間接血凝試驗也存在不足，包括重複性比較差，致敏紅細胞不穩定和易發生非特異凝集等缺點。
乳膠凝集試驗（LAT）。乳膠凝集試驗是將乳膠顆粒包被可溶性的抗原，加入待檢血清後充分振蕩混勻，室溫過夜後進行觀察；如果發生凝集現象，則證明感染弓形蟲。該方法操作簡單，結果易於觀察，但費時且特異性不強，在弓形蟲檢測中不常使用。
改良凝集試驗（MAT）。改良凝集試驗是由Dubey和Desmonts於1987年在直接凝集試驗的基礎上建立了一種敏感的弓形蟲檢測方法。Feg等用此試驗方法對散養的雞群進行了檢測，結果發現散養雞群感染率為16.6%。Heddergott等也用此試驗方法對浣熊進行了檢測，發現有37.4%的浣熊感染弓形蟲。該方法特異敏感性強，但存在費時、檢測費用高等缺點。
酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
ELISA試驗是利用酶的高效催化作用以及底物放大的反應原理，提高特異性抗原和抗體免疫反應檢測的敏感性。該方法可以檢測出弓形蟲感染各個時期的IgM、IgG、IgA和IgE抗體，敏感性較好。管剛等2008年用弓形蟲的重組蛋白P30作為抗原建立了ELISA方法，並用此方法對收集的139份豬血清抗體進行檢測，共檢測出陽性血清8份，陽性率為5.76%。羅才慶等比較ELISA和HAT試驗方法，結果表明ELISA更適合用於檢測豬弓形蟲抗體。近年來隨著該技術的不斷發展，科研人員又研究出了許多改進方法，如葡萄球菌A蛋白ELISA、斑點酶聯免疫吸附試驗（Dot-ELISA）、PCR-ELISA、雙夾心酶聯免疫吸附試驗（DS-ELISA）等。據調查，ELISA檢測方法是國內外學者以及實驗室檢測弓形蟲抗體最常用的方法。目前，已研製出反應靈敏、特異性高、重複性好的動物弓形蟲ELISA試劑盒。如：檢測弓形蟲 IgM抗體的間接 ELISA法試劑盒（該種方法對於急性病例檢出率較高，但類風溼因子陽性者易出現假陽性反應），可去除類風溼幹擾的雙夾心法ELISA檢測試劑盒。
間接螢光抗體試驗（FAT）
間接螢光抗體試驗是用固定的弓形蟲速殖子製作抗原片，通過螢光素標記的二抗檢測特異性抗體。此方法特異性和敏感性較高，重複性也很高，在國外被廣泛應用。但我國利用FAT方法檢測弓形蟲的報導非常少。此試驗方法需要用專業螢光顯微鏡來進行觀察，所以在國內沒有大面積推廣使用。
分子生物學診斷
核酸探針技術
核酸探針技術又被稱為核酸雜交技術（nucleic acid hybridization），是1968年華盛頓卡內基學院的Roy Britten及同事們所發明。核酸探針技術作為重要的分子生物學技術，通過將特定的病原基因序列分離純化後標記作為探針，與待檢的DNA和RNA單鏈形成雜交雙鏈，最後將標記物洗去，用自顯影技術對其檢測，從而檢測出與特定序列結合的核酸樣品，最終達到檢測病原的目的。Blanco等建立弓形蟲RH株基因文庫，從中篩選出pTg4重複片段。將此片段用放射性同位素32P標記作為探針，可檢測到80pg純化的弓形蟲基因組DNA。由於放射性同位素標記的核酸探針容易汙染環境，且對人體有一定損害，所以在使用上受到一定的限制。
聚合酶鏈式反應（PCR）
PCR技術可以在比較短的時間內對弓形蟲基因組特定的片段進行擴增，通過擴增產生數百萬個拷貝的靶DNA分子。Nabi等對PCR方法與顯微鏡法進行了比較，對於檢測貓糞便弓形蟲卵囊，PCR檢測方法更為可靠。Lukasove等分別收集了南非野鳥、家養鳥的110份、15份腦組織樣本，並對其進行了PCR檢測，發現2.7%的野鳥感染了弓形蟲。研究表明，PCR檢測方法速度快、靈敏度高、結果可靠。正因如此，PCR技術才得以廣泛使用，在弓形蟲病的臨床診斷中佔有重要作用。
環介導等溫擴增技術（LAMP）
LAMP是Notomi等人在2000年開發的一種等溫核酸擴增方法。LAMP是在BstDNA聚合酶的參與下，用4對引物識別弓形蟲靶基因的6個區域，在等溫條件下使靶基因高效擴增。擴增產物既可以通過螢光定量、電泳檢測，也可以通過離心後肉眼觀察沉澱。LAMP進行檢測時只需要水浴或者用普通的加熱裝置，就可以直接觀察出擴增的產物。因此LAMP是在沒有精密儀器下，仍能快速、簡便得出結果的一種檢測方法。此方法的靈敏度和擴增效率要比常規的PCR方法高很多。Zhang等根據弓形蟲529bp重複序列建立LAMP方法，與常規PCR方法同時對疑似感染弓形蟲的豬淋巴結樣本進行檢測，結果LAMP陽性率為85.7%，而常規PCR陽性率為76.9%；Krasteva等利用弓形蟲單一拷貝的SAG1基因設計引物建立了LAMP診斷方法，對人工感染弓形蟲小鼠的不同組織樣本進行弓形蟲檢測，並與常規PCR方法進行比較，發現其靈敏度明顯高於常規PCR。
展望
弓形蟲病是一種人獸共患病，不僅對畜牧業造成嚴重的經濟損失，而且對人類健康也構成了嚴重威脅。由於該病臨床症狀缺乏較強的特異性，導致檢測技術發展較慢。隨著國內外對弓形蟲病研究的重視，未來適合於大量樣品檢測以及流行病學調查的商品化ELISA方法試劑盒，可直接對多種組織中弓形蟲病原進行檢測的商品化分子生物學試劑盒將得到進一步推廣和應用，從而快速、準確診斷出弓形蟲病原，以達到預防控制弓形蟲病，減少經濟損失和保障人類健康的目的。