文章來源：中華內分泌代謝雜誌, 2020,36(12) : 1062-1069.
作者：任紫敬 陳慧 陳思聰 翟華立 詹軼群 於淼 葛志強 楊曉明
摘要 探究肝細胞核因子1α(HNF1α)通過葡萄糖轉運蛋白(GLUT)調控腎臟葡萄糖重吸收的機制。構建小鼠HNF1α表達載體，將重組質粒轉染人胚腎HEK293T細胞和人腎小管上皮細胞HK2中過表達HNF1α，將HNF1α siRNA和GLUT2 siRNA轉染入HEK293T細胞，採用流式細胞儀檢測螢光葡萄糖類似物2-NBDG被細胞吸收的情況。採用Western印跡法檢測HNF1α基因沉默後對GLUT2表達的影響。通過實時定量PCR檢測HNF1α下遊靶基因如GLUT2、鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2(SGLT2)、胰島素誘導基因1(INSIG1)等的mRNA水平，通過共聚焦免疫螢光檢測GLUT2在腎上皮細胞的定位情況，使用螢光素酶報告基因和Western印跡法檢測HNF1α對GLUT2的轉錄激活能力。通過凝膠遷移實驗(EMSA)和染色質免疫共沉澱(ChIP)實驗檢測HNF1α與GLUT2的結合作用。過表達HNF1α攝取2-NBDG的細胞比例明顯高於對照組(P<0.01)，HNF1α和GLUT2基因沉默後細胞對2-NBDG吸收作用減弱，HNF1α基因沉默後GLUT2表達減少。與對照組相比，過表達HNF1α使得腎臟包括GLUT2在內的有關糖轉運基因表達水平上升(P<0.01)。過表達HNF1α顯著增加GLUT2轉錄活性，幹涉HNF1α可下調GLUT2轉錄活性。此外，HNF1α可與GLUT2的啟動子直接結合。HNF1α通過直接結合GLUT2促進其表達，進而調節腎源細胞對葡萄糖重吸收作用。肝細胞核因子(hepatocyte nuclear factor, HNF)1α是一種在肝臟、腎臟、胰腺和消化道中表達的以二聚體形式存在的含同源結構域的蛋白質。其結構由3個功能區組成，包括由前32個胺基酸編碼的N端二聚體區、與DNA結合的POU樣同源結構域和C端部分的轉錄活化區[1]。HNF1α在肝臟、胰、腎臟和腸代謝中發揮重要作用，調控胰島素和葡萄糖相關轉運蛋白的表達水平，是葡萄糖穩態的主要調節因子[2]。此外，HNF1α還影響小腸、腎臟發育及腎上皮細胞的分化及葡萄糖和離子的重吸收[3]。HNF1α突變在多數情況下會引發3型青少年發病的成人糖尿病，其特點是β細胞功能缺陷、葡萄糖刺激胰島素分泌不良等[4]。HNF1α缺陷的小鼠肝、腎、胰等器官均會出現病變，表現為肝功能紊亂、腎範可尼症候群(一種導致尿液中嚴重葡萄糖損失的遺傳性疾病)、2型糖尿病等多種代謝相關疾病[5]。
腎臟對葡萄糖的重吸收是一個從尿液空間到間質空間的單向過程，是由定位於腎近端腎小管細胞的腔和基底外側表面兩個連續的葡萄糖轉運蛋白(GLUT)系統進行的，腔內葡萄糖的內流是由鈉-葡萄糖協同轉運蛋白(SGLT)介導的[6,7,8]。一旦葡萄糖聚集在細胞中，其通過定位在基底外側膜上特定的促GLUT擴散到間質空間[9,10,11,12,13]。在小鼠和人類中敲除這些轉運蛋白可導致尿液中過濾葡萄糖的排洩。此外，對腎範可尼症候群的研究指出，GLUT2是其中的重要原因[14]。
雖然已有數據表明，HNF1α影響腎臟葡萄糖的重吸收，但其具體調控機制尚不明確。本文通過研究過表達HNF1α對腎臟葡萄糖重吸收過程中GLUT2的影響，為進一步闡明HNF1α對腎臟葡萄糖重吸收調控機制及HNF1α的生理學功能研究提供理論基礎。
一、材料
人胚腎細胞HEK293T細胞系、人腎小管上皮細胞HK2細胞系、小鼠腎小管上皮細胞TCMK細胞系由本實驗室保存。質粒pGL3-GLUT2為實驗室前期工作獲贈保存[15]。HNF1α抗體(sc-393925x)、myc抗體(sc-40)、GLUT2 siRNA(sc-35495)、HNF1α siRNA(sc-35567)均購自美國Santa Cruz公司，羊抗鼠IgG(AS003)購自美國ABclonal公司，兔多克隆抗GLUT2(20436-1-AP)、羊抗兔lgG(SA00001-2)均購自美國Proteintech公司，異硫氰酸螢光素標記羊抗小鼠lgG(ZF-0312)購自北京中杉金橋公司，Trizol購自美國Gibco公司。Vigofect轉染試劑購自北京威格拉斯公司，反轉錄試劑盒購自北京擎科公司，雙報告基因測定試劑盒購自美國Promega公司。LightShift Chemiul-uminescent EMSA Kit、2-NBDG購自美國Thermo Fisher Scientific公司。核蛋白提取試劑盒M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent購自Pierce公司。SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit購自CST公司。其餘試劑均為國產分析純。
二、方法
1．細胞培養：
HEK293T細胞系、TCMK細胞系由Dulbecco改良型高糖培養基加10%胎牛血清培養，HK2細胞系由Dulbecco改良型高糖培養基DMEM/F12加10%胎牛血清培養。
2．重組質粒的構建：
以pcDNA3.1myc-HisB質粒作為載體，根據NCBI網站報導的小鼠HNF1α cDNA序列設計引物，引物序列見表1。以小鼠肝組織提取RNA反轉錄的產物cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增條件：94℃ 2 min，98℃ 10 s，65℃ 30 s，68℃ 3 min 42 s。將小鼠HNF1α cDNA擴增產物插入pcDNA3.1myc-HisB的T7啟動子下遊。
3．流式細胞儀檢測：
將HEK293T細胞和HK2細胞分別接種於24孔板中，待其長至合適密度進行轉染。24 h後收細胞。收細胞前1 h，用不含Na＋的磷酸緩衝鹽溶液(PBS)洗滌3次。按實驗設計的方案每孔分別用100 μl含Na＋緩衝液[包括140 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2.5 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgSO4，1 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(pH 7.4)]和不含Na＋的緩衝液(包括140 mmol/L N-甲基-D-葡萄糖胺代替NaCl)，與2-NBDG共同孵育1 h。1 h後收細胞，用不含Na＋的PBS清洗細胞1次，流式細胞儀檢測細胞對2-NBDG的吸收情況。
4．RNA提取和實時定量PCR：
用TRIzol裂解HEK293T細胞，3 μg RNA反轉錄為20 μL cDNA，SYBR Green Master MIX，TBP為內參基因。使用IQ5 real-time PCR檢測系統實時檢測樣本中的螢光染料，根據軟體提供的循環閾值計算出基因表達的相對值。腎相關基因實時定量PCR引物序列見表2。
5．免疫螢光：
在6孔板中將已爬細胞玻片用PBS清洗3次，4%的多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，使用1%TritonX-100透化15 min，PBS清洗3次，牛血清蛋白封閉2 h，滴加稀釋好的一抗(1∶50)4℃孵育過夜，PBS清洗後加入螢光二抗(1∶50)，室溫1 h後，PBS清洗後加入Hoechst避光孵育10 min，PBS清洗後用50%甘油封片，使用雷射共聚焦顯微鏡上鏡觀察。
6．免疫組化：
通過尾靜脈注射體內轉染試劑將質粒轉染入小鼠體內，24 h處死動物，取出小鼠的腎組織，置於12%甲醛溶液中浸泡7 d以上。免疫組化HE染色由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所病理實驗室協助完成。
7．螢光素酶報告基因實驗：
每孔轉染1.25 μg質粒(不足用空載體補足)，按照Vigofect轉染試劑說明書進行轉染。6 h後換液，24 h後收集細胞，每孔加入100 μL被動裂解液進行裂解，取30 μL進行螢光素酶報告基因的檢測。
8．凝膠遷移實驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)：
接種HEK293T細胞，分別轉染24 h後900轉/min 5 min收集細胞，提取核蛋白，核提取物與生物素標記的雙鏈寡核苷酸GLUT2 5′-TGCCAAACATTTATCA-3′共孵育。轉膜：100 mA恆流45 min，紫外交聯20 min。將膜浸泡在封閉液中封閉15 min，按1∶300配製抗體，將膜浸泡在抗體溶液中孵育15 min，洗滌4次。將膜浸泡在底物平衡液中5 min，進行化學發光反應。
9．染色質免疫共沉澱(ChIP)實驗：
於HEK293T細胞中按實驗設計轉染質粒，24 h後加入37%的甲醛至終濃度為1%，旋轉混勻，室溫固定，加入甘氨酸至終濃度為0.125 mol/L，渦旋混合後室溫終止5 min。移除培養基，用預冷的PBS洗滌細胞2次，加入預冷PBS＋蛋白酶抑制劑，4℃ 2 000轉/min離心5 min。移除上清進行胞核製備和染色質消化。然後進行染色質免疫沉澱，最後純化DNA。
使用HNF1α下遊靶基因GLUT2啟動子區結合序列5′-CACTCTGGCTGGTCAGCTATTCAT-3′，3′-CCAA-AACTCCTCCAACCCTTAGAT-5′對純化的DNA進行實時定量PCR擴增，對得到的結果進行統計學分析。
三、統計學處理
採用GraphPad Prism7進行數據處理，計量數據用Mean±SD表示，多組間比較採用方差分析進行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。
結 果
一、HNF1α促進腎相關細胞葡萄糖類似物的重吸收作用
在HK2和HEK293T細胞中分別轉染空載體pcDNA3.1myc-HisB為對照組，pcDNA3.1-HNF1α-myc為實驗組，分別用含Na＋和不含Na＋的緩衝液與螢光葡萄糖類似物2-NBDG共同避光孵育後用流式細胞儀檢測細胞對2-NBDG的吸收情況。結果如圖1所示，無論是在293T細胞還是HK2細胞中，不管是否含Na＋離子，過表達HNF1α對2-NBDG吸收的細胞比例均明顯高於對照組(P<0.01)。結果表明，HNF1α能夠促進293T細胞和HK2細胞的葡萄糖重吸收作用。
圖1 HK2和HEK293T細胞中，HNF1α促進SGLT2和GLUT2對腎葡萄糖的重吸收作用
Fig 1 In HK2 and HEK293T cells, HNF1α promote the reabsorption of renal glucose by SGLT2 and GLUT2
二、過表達HNF1α影響腎臟糖轉運相關基因mRNA水平
在HEK293T細胞中分別轉染pcDNA3.1-myc和pcDNA3.1-HNF1α-myc，通過實時定量PCR檢測腎細胞中HNF1α靶基因的表達水平。結果顯示，過表達HNF1α使SGLT2、GLUT2、半乳糖苷酶α(galactosidase α，GLA)、胰島素誘導基因1(insulin induced gene 1, INSIG1)、分泌性磷蛋白1(secreted phosphoprotein 1, SPP1)、角蛋白19(keratin 19, KRT19)等基因的表達上升(P<0.05或P<0.01，圖2)。結果提示，HNF1α可能通過調節糖轉運相關基因影響腎臟葡萄糖重吸收。
圖2 HEK293T細胞中過表達HNF1α促進相關轉運蛋白基因表達
Fig 2 Overexpression of HEKHNF1α in 293T cells promotes related transporter gene expression
三、HNF1α促進腎細胞葡萄糖吸收的作用依賴於GLUT2
鑑於GLUT2在腎糖重吸收中的重要作用，在HEK293T細胞中分別轉染HNF1α siRNA和GLUT2 siRNA為實驗組，收集細胞前與螢光葡萄糖類似物2-NBDG共同避光孵育1h後用流式細胞儀檢測細胞對2-NBDG的吸收情況。結果顯示，HNF1α基因沉默後細胞對2-NBDG的吸收作用減弱，細胞轉染GLUT2 siRNA後降低了對2-NBDG的吸收作用，通過免疫螢光實驗證實了GLUT2定位於腎小管上皮細胞，表明HNF1α促進腎細胞葡萄糖重吸收的作用依賴於GLUT2, Western印跡結果顯示HNF1α基因沉默後減弱了GLUT2的表達(圖3)。
圖3 HNF1α促進腎細胞葡萄糖吸收的作用依賴於GLUT2
Fig 3 The role of HNF1α in promoting glucose absorption in kidney cells depends on GLUT2
四、HNF1α對GLUT2的轉錄激活作用
用報告基因實驗檢測HNF1α對GLUT2的轉錄調控。在HK2細胞、HEK293T細胞和TCMK細胞中分別共轉染pcDAN3.1-myc和GLUT2-luciferin、HNF1α和GLUT2-luc，24 h後裂解細胞檢測螢光素酶報告基因。結果顯示，與對照組相比，HNF1α對GLUT2報告基因具有明顯的激活作用，轉染10 ng HNF1α在293T細胞和HK2細胞中激活作用達5倍以上，在TCMK細胞中激活作用約為2.2倍。而且這種激活作用具有明顯的劑量依賴效應。HEK293T細胞中，無論是幹涉內源的HNF1α，還是在過表達外源HNF1α後再進行幹涉，都顯著降低GLUT2報告基因的活性(P<0.05或P<0.01，圖4)。
圖4 表達HNF1α促進對GLUT2的轉錄激活作用
Fig 4 HNF1α promotes transcriptional activation of GLUT2
五、HNF1α與GLUT2的結合作用
通過EMSA實驗檢測HNF1α是否可以直接結合在GLUT2啟動子區：在HEK293T細胞中分別轉染對照載體pcDNA3.1-myc和pcDNA3.1-HNF1α-myc，24 h後收集細胞提取細胞核蛋白，標記探針選用GLUT2啟動子區HNF1α結合部位序列。結果如圖4所示，在pcDNA3.1-myc組沒有形成明顯的阻滯條帶，而在HNF1α組可以看到探針能夠與細胞核蛋白質結合形成阻滯條帶(圖4A，泳道2和泳道3)，加入競爭型冷探針時阻滯條帶減弱(圖4A，泳道4和泳道5)。加入HNF1α的特異性抗體的超阻滯組中條帶明顯滯後，提示該條帶確實是HNF1α與DNA形成的複合體條帶(圖4A，泳道7)。
ChIP實驗驗證HNF1α與GLUT2的結合：在HEK293T細胞中分別轉染對照載體pcDNA3.1-myc和pcDNA3.1-HNF1α-myc，24 h後收集細胞提取核蛋白，採用HNF1α抗體進行ChIP，純化後的DNA用實時定量PCR檢測。結果如圖所示，與對照組相比，HNF1α顯著富集在GLUT2啟動子區(P<0.01，圖5B)，說明HNF1α可以直接與GLUT2啟動子結合。
圖5 HNF1α與GLUT2的結合作用
Fig 5 The binding of HNF1α to GLUT2
討 論
本研究發現在腎源細胞，如HEK293T細胞和HK2細胞中過表達HNF1α能促進腎小管上皮細胞對葡萄糖的重吸收作用，HNF1α和GLUT2基因沉默後腎小管上皮細胞對葡萄糖重吸收作用減弱，其分子機制是通過HNF1α與GLUT2啟動子直接結合進而促進其轉錄實現的。
HNF1α表達在多種上皮細胞中，如肝臟、腎臟、小腸、胰腺等，參與代謝物的分泌與重吸收過程，作為一種轉錄因子，HNF1α含有在進化上相當保守的DNA結合區，該區通過與各種靶基因調控區順式作用元件的結合，調節靶基因的表達，從而在轉錄水平對細胞分化和代謝過程起重要作用[16]。HNF1α可以結合肝臟200種以上基因的啟動子區，參與蛋白質合成、膽汁酸代謝、膽固醇代謝；在胰腺中，HNF1α可以調節胰島素的表達；在小腸上皮細胞中，HNF1α通過調節Cdx2影響水分吸收[17]；在腎臟中，HNF1α主要表達在近端小管，通過調節SGLT2和NPT1影響葡萄糖和磷酸鹽重吸收[18]。本研究利用螢光素酶報告基因實驗證實HNF1α可以激活GLUT2啟動子報告基因，說明HNF1α可以調節其轉錄活性。隨後通過EMSA和ChIP實驗證實，HNF1α可以直接結合在GLUT2啟動子區。
GLUT2在肝臟、胰腺、小腸以及腎臟表達，與HNF1α表達譜高度相似，是定位在細胞膜表面的參與葡萄糖雙向轉運的跨膜蛋白質。本研究通過共聚焦免疫螢光檢測到GLUT2定位於腎小管上皮細胞。全基因組關聯研究報告顯示，GLUT2變異增加空腹高血糖、2型糖尿病、高膽固醇血症和心血管疾病發生發展的風險。有報導顯示，GLUT2的失活突變導致腎範可尼症候群，其特點是肝腫大並伴有葡萄糖尿和胺基酸尿[19]。這與HNF1α缺失小鼠表型一致，提示HNF1α異常引發的腎範可尼綜合症可能與其對GLUT2的調節紊亂有關。
HNF1家族包括HNF1α和HNF1β這2個成員，能以同源或異源二聚體的形式與DNA結合[20]。已有研究更多地集中在HNF1α對肝臟和胰腺功能的影響，而對腎臟功能的調節多集中於HNF1β分子。研究表明，HNF1β通過調節PKD2(polycystin 2)和PKHD1(polycystic kidney hepaticdisease 1)表達影響腎小管發育，HNF1β的缺失導致腎單位異常，表現為腎小球Bowman囊擴張和缺乏典型腎小管[21]。關於HNF1α調節腎臟功能的分子機制研究有限。本研究發現，在人胚腎細胞系HEK293細胞中過表達HNF1α可以顯著上調腎糖轉運的基因包括INSIG1、GLUT2和SGLT2的mRNA水平，為HNF1α調節腎臟葡萄糖重吸收提供了新的證據。
綜上所述，HNF1α影響腎上皮細胞的重吸收功能，提示HNF1α可能在腎範可尼症候群、2型糖尿病等的發生和發展過程中發揮重要作用。進一步研究HNF1α的作用機制對相關疾病的發病機制和治療具有重要意義。
參考文獻 （略）