【實驗目的】
（1）掌握幾種常用的細菌染色方法。
（2）初步認識細菌的形態和結構特徵。
【實驗原理】細菌的個體形態主要分為球菌、桿菌和螺旋菌（圖3-1）。有的細菌細胞除了細胞壁、細胞膜等基本結構以外，還具有芽孢、莢膜、鞭毛等特殊結構，是菌種分類鑑定的重要指標。由於細菌細胞既小又透明，直接在顯微鏡下觀察時難以識別，故一般要經過染色才能做形態和結構的觀察。用於生物染色的染料主要有鹼性染料、酸性染料和中性染料三大類。在中性、鹼性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，而鹼性染料在電離時帶正電荷，所以很容易與細胞結合而使細菌著色，因此細菌染色多用鹼性染料。常用的鹼性染料有美藍、結晶紫、番紅、孔雀綠等。
圖3-1 細菌基本形態顯微照片a．球菌；b．桿菌；c．螺旋菌細菌染色的方法很多，以下介紹幾種常用的染色方法。
簡單染色法：是利用一種染料對細菌進行染色的方法。該法操作簡單方便，只適用於細菌形態和排列方式的觀察。
革蘭氏染色法：由丹麥病理學家Hans Christian Gram於1884年創立，是細菌學中最重要的鑑別染色法。各種細菌經革蘭氏染色後，可分為革蘭氏陽性菌（G＋）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。其基本步驟分為：結晶紫初染，碘液媒染，乙醇（或丙酮）脫色和番紅復染。一般認為，革蘭氏染色原理與細菌細胞壁結構和組成有關。G＋菌細胞壁的肽聚糖層厚，類脂質少，當乙醇脫色時，肽聚糖因脫水而使網孔縮小，通透性降低，故能保留結晶紫-碘複合物在細胞膜上，細胞呈紫色；而G-菌細胞壁的肽聚糖層薄，類脂質多，乙醇將類脂質溶解，增加了細胞壁的通透性，結晶紫-碘複合物被溶出細胞壁，最後番紅復染後使細胞呈紅色。
芽孢染色法：芽孢是某些細菌在其生長發育後期，在細胞內形成的一個圓形或橢圓形的休眠構造（圖3-2a）。細菌的芽孢具有厚而緻密的壁，透性低，不易著色。芽孢染色法就是根據芽孢既難以被染色而一旦染上色後又難以脫色這一特點而設計的。用鹼性染料孔雀綠在加熱條件下染色，使染料不僅進入菌體，也可進入芽孢內。進入菌體的染料經水洗後被脫色，而芽孢一經著色後難以被水洗脫色，當用對比度大的復染劑染色後，芽孢仍保留初染劑的顏色，而菌體被染成復染劑的顏色，使芽孢和菌體易於區分。
莢膜染色法：莢膜是包圍在細菌細胞外的一層黏狀物質，其成分為多糖、糖蛋白或多肽。由於莢膜與染料的親和力弱、不易著色，所以通常用負染色法染色，即菌體和背景著色，而莢膜不著色，在菌體周圍形成透明圈（圖3-2b）。由於莢膜含水量高，製片時通常不用熱固定，以免夾膜變形，影響觀察。鞭毛染色法：細菌的鞭毛極細，直徑一般為10～20nm，只有用電子顯微鏡才能觀察到（圖3-2c）。但是，如採用特殊的鞭毛染色法，則在普通光學顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛加粗，然後再進行染色。
圖3-2 細菌特殊結構顯微照片（引自M.T.馬迪根）a．細菌芽孢；b．細菌莢膜；c．細菌鞭毛
【實驗器材】
1．菌種金黃色葡萄球菌（Staphy loccocus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）、蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）或自備菌種。
2．染色液和試劑草酸銨結晶紫、盧哥氏碘液、95％酒精、番紅、5％孔雀綠水溶液、繪圖墨水、硝酸銀染色液、二甲苯、香柏油等。3．儀器和用具廢液缸、洗瓶、載玻片、接種環、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡、小試管（75mm×10mm）、燒杯、滴管、玻片擱架、鑷子、吸水紙、記號筆等。
【實驗步驟】
1．簡單染色法
（1）塗片：在潔淨無油膩的玻片中央放一小滴水，按無菌操作的方法（圖3-3）用接種環挑取少量金黃色葡萄球菌或大腸桿菌菌種與水滴充分混勻，塗成極薄菌膜。注意：取菌量要適當，且塗抹要均勻，避免因取菌太多而造成塗片細胞堆積難以看清細菌個體形態。
圖3-3 製備塗片的無菌操作過程a．接種環滅菌；b．拔管塞；c．管口滅菌；d．取菌種；e．管口滅菌；f．塞管塞；g．塗布；h．灼燒接種環
（2）乾燥：讓塗片自然晾乾或用電吹風吹乾。
（3）固定：手執玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰兩三次（以玻片背面不燙手為宜）。注意：必須等塗片乾燥後再加熱固定，且避免固定時間過長而使細胞形態破壞。
（4）染色：將塗片置於玻片擱架上，加適量（以蓋滿菌膜為宜）草酸銨結晶紫染色液染色1～2min。
（5）水洗：倒去染色液，用洗瓶小水流衝洗，直至塗片上流下的水無色為止。
（6）乾燥：用吸水紙吸去水分，自然乾燥或用電吹風吹乾。
（7）鏡檢：塗片完全乾燥後鏡檢，從低倍鏡到高倍鏡，最後用油鏡觀察。簡單染色法的操作流程見圖3-4。
圖3-4 細菌的簡單染色法（引自M.T.馬迪根）
2.革蘭氏染色法
（1）製片：分別取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌斜面培養物常規塗片、乾燥、固定（同上）。注意：宜選用幼齡培養物，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養約24h。塗片宜薄，以免脫色不完全造成假陽性。
（2）初染：滴加結晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）染色1～2min，水洗。
（3）媒染：用碘液衝去殘水，並用碘液覆蓋約1min，水洗。
（4）脫色：將載玻片傾斜，在白色的背景下，用滴管流加95％乙醇脫色，直至流下的乙醇剛好無紫色時，立即水洗。注意：革蘭氏染色成敗的關鍵是乙醇脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌可能被染成假陰性；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也可能被染成假陽性。
（5）復染：用番紅液復染約2min，水洗。
（6）鏡檢：乾燥後，用油鏡觀察。
3．芽孢染色法
（1）製片：按常規方法將巨大芽孢桿菌塗片、乾燥、固定（同上）。
（2）染色：加數滴5％孔雀綠染色液於塗片上，用木夾夾住載玻片一端，在酒精燈上方用微火加熱，以染料冒蒸汽而不沸騰為宜，並開始計時，維持5min。注意：加熱過程中切勿讓染色液沸騰，並及時補加染色液，切勿讓塗片乾涸。
（3）水洗：待玻片冷卻後，用水輕輕地衝洗，直至流出的水中無染色液顏色為止。
（4）復染：用番紅液染色2min。
（5）水洗：用水洗去染色液。
（6）鏡檢：乾燥後，用油鏡觀察。4．莢膜染色法
（1）制混合液：加1滴墨水於潔淨的載玻片上，挑少量膠質芽孢桿菌菌體與其充分混合均勻。
（2）加蓋玻片：放一清潔蓋玻片於混合液上，然後在蓋玻片上放一張濾紙片，向下輕壓，吸去多餘的菌液。注意：勿產生氣泡，以免影響觀察。
（3）鏡檢：先用低倍鏡再用高倍鏡觀察。
5．鞭毛染色法（硝酸銀染色法）
（1）菌種的準備：取經活化的幼齡蘇雲金桿菌菌種。
（2）載玻片的準備：將載玻片在含適量洗衣粉的水中煮沸約20min，取出用清水充分洗淨，瀝乾水後浸於95％乙醇中，用時取出在火焰上燒去酒精及可能殘留的油跡。（3）菌液的製備：取斜面菌種數環於裝有1～2mL無菌水的試管中，製成菌懸液。
（4）製片：取菌液1滴滴於載玻片的一端，將玻片傾斜，使菌液緩緩流向另一端，用吸水紙吸去玻片下端多餘的菌液，室溫自然乾燥。
（5）染色：塗片乾燥後，滴加硝酸銀染色A液覆蓋3～5min，用蒸餾水充分洗去A液。用B液衝去殘水後，再加B液覆蓋塗片染色數秒至1min，當塗面出現明顯褐色時，立即用蒸餾水衝洗。若加B液後顯色較慢，可用微火加熱，直至顯褐色時立即水洗。自然乾燥。
（6）鏡檢：幹後用油鏡觀察，可從玻片的一端逐漸移至另一端觀察。
【實驗報告】
1．實驗結果
（1）繪製金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的形態圖，並註明兩種菌的革蘭氏染色結果。
（2）繪製芽孢桿菌形態圖（示意芽孢位置）。
（3）繪製鞭毛細菌的形態圖。
2．思考題
（1）進行革蘭氏染色時，為什麼特別強調菌齡不能太老，用老齡細菌染色會出現什麼問題？
（2）觀察芽孢、莢膜和鞭毛結構時，所用菌種菌齡有什麼不同？（張應烙）