編譯：謝卓婷 米冰倩 魏韜（華南農業大學食品學院）
纖維素生物質的可持續利用是一種生產有價值化合物的理想的方法，但是難降解纖維素的水解既複雜又費時。一些纖維素分解細菌產生了名為「纖維素小體」的多酶複合物，可有效降解纖維素。因此，在工業酵母中構建纖維素小體一直是科學家追求的目標。然而，由於纖維素基因的大小和複雜性，使得該研究具有很高的挑戰性。
本實驗中研究人員對克魯維酵母進行了改造，使其在細胞表面表達「最大的纖維素分解複合物」，該複合物最多可容納63種酶，這是迄今為止酵母中最大的工程化纖維素小體。由於纖維素酶在纖維素小體中的協同作用，該工程酵母顯示出更高的降解效率，並且從纖維素底物中釋放的還原糖和乙醇的量明顯高於以前的任何構建體。
纖維素小體是由高溫梭菌和其他厭氧性纖維素分解細菌產生的高效超分子酶複合物。典型的熱纖梭菌纖維素酶體由一個中央非酶支架的蛋白亞基（稱為「纖維素酶融合蛋白A」（CipA））和九種I型黏附蛋白組成。CipA包含一個不可分割的纖維素結合模塊（CBM），該模塊可結合纖維素底物。整個支架蛋白和酶亞基通過CipA的II型碼頭蛋白與三種表面錨定蛋白SdbA，Orf2p或OlpB之一的II型粘著蛋白之間的相互作用連接到細菌細胞表面。「外層蛋白B」（OlpB）通常包含7種II型粘著蛋白。
纖維素蛋白的示意圖。（A）具有不同數目的粘著蛋白和CBM的仿生支架（CipA）。在支架蛋白名稱中，「 B」代表CBM的數量，「 C」代表粘著蛋白的數量。例如，CipA1B9C表示CipA中存在一個CBM和九個黏附素。（B）與dockerin T融合的真菌纖維素酶。（C）具有7種II型黏附蛋白和ScGPI細胞表面錨定的外層支架蛋白B（OlpB）。（D）ScafT含有CBM和黏附素T。（E）本研究中使用的工程酵母宿主概觀。（F）在馬克斯克魯維酵母的細胞表面上具有63種酶的工程化的纖維素複合體的示意圖。
近年來，幾組研究人員成功地在釀酒酵母細胞表面表達了微型化的纖維素體，稱為「微型纖維素體」，並使用微晶纖維素證明了其纖維素分解和乙醇生產的能力。與游離或固定化酶相比，微纖維素酶中的酶顯示出增強的活性。但是，微纖維體僅包含少量粘著蛋白，因此只能容納幾種酶，從而限制了酶的協同作用。由於CipA和OlpB基因的粘附素中大量的TR，缺乏穩定的染色體整合策略，低蛋白表達和宿主的分泌能力，因此將大型纖維素複合體工程化到酵母基因組中仍然具有很高的挑戰性。現有策略使用游離質粒表達微纖維素體，以提高蛋白質產量。然而，游離表達需要誘導和恆定選擇，因此增加了生產成本並增加了穩定性問題。
該項研究的目的是用最大的纖維素複合體對馬克斯克魯維酵母進行工程改造，該複合體可以在細胞表面容納多達63種酶。為此，研究人員合成了CipA基因（具有9個I型粘附素重複序列）和最大的OlpB基因（具有7個II型粘附素重複序列）。CipA和OlpB基因中的多個重複序列使其克隆甚至DNA合成都極為困難。研究人員通過將重複序列中的密碼子隨機化並使用高級DNA合成技術合成了CipA和OlpB基因，以此克服這個問題。隨後研究人員將這兩個基因整合到馬克斯克魯維酵母基因組中。此外，為了了解CipA的粘著蛋白數量和CBM在微囊菌降解中的重要性，研究人員還構建了具有不同數目的粘著蛋白和CBM的CipA變體。
纖維素向單糖的轉化至少需要三種酶：內切葡聚糖酶（EGs），外切葡聚糖酶（CBHs）和β-葡萄糖苷酶（BGSs）。此外，已經報導了一類新的氧化酶，稱為溶解性多糖單加氧酶（LPMO）。LPMO可以有效降解結晶纖維素，並使可溶性糖釋放增加2.6倍，因此被稱為「纖維素酶促進劑」。LPMO的活性需要電子，因此將一種稱為纖維二糖脫氫酶（CDH）的電子供體與LPMO一起使用。因此，研究人員選擇了三種類型的真菌纖維素酶，分別是裡氏木黴（TrEgIII）的EG，合成的CBH（CBHII），來自Neocallimastix patriciarum的β-葡萄糖苷酶（NpaBGS）以及纖維素酶增強劑來自Aurantiacus（TaLPMO）和來自嗜熱毀絲黴（Thermothelomyces thermophila）（MtCDH）的電子供體，然後將其與C. thermocellum的I型dockerin融合以促進纖維素的整合。工程纖維素酵母菌株有效地將微晶纖維素轉化為還原糖或乙醇，適用於整合生物加工（CBP）。
在這項研究中，研究人員設計產生了幾種纖維素宿主，包括纖維素酶宿主（CH：表達TrEgIII-t，CBHII-t和NpaBGS-t），加強宿主（BH：表達TaLPMO-t和MtCDH-t），酶宿主（EH：表達TrEgIII-t，CBHII-t，NpaBGS-t，TaLPMO-t和MtCDH-t）和AH（表達OlpB-ScGPI）。同樣，通過將CipA變異體整合到表達AH的OlpB-ScGPI中，開發了五種不同類型的支架蛋白宿主（SH）。最後，將EH和AH共同培養形成最大的纖維素體，然後分別使用微晶纖維素（avicel）和磷酸溶脹的纖維素（PASC）來驗證乙醇的生產（如下圖）。
本實驗研究人員將纖維素酶基因整合到酵母基因組中，由於其基因的拷貝數較低，研究人員使用了較高的初始接種量（20光密度[OD]）來加快消化速度。將來，他們將研究在宿主中增加基因拷貝數或使用新的啟動子（即TEF，ADH3或TDH3）是否可以改善工程宿主的性能。
論文連結：
https://www.pnas.org/content/117/5/2385/lF6