Science：當乘風破浪的「Flow」遇上蛋白質合成

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蛋白質是組成人體一切細胞、組織的重要成分，是生命的物質基礎，而且，蛋白質和多肽類藥物在製藥領域也有舉足輕重的作用。近年來，基於生物學方法或化學方法的蛋白質合成已經成為了學術界和工業界中非常重要的一部分。事實上，大多數蛋白質是通過生物學方法獲得的，在生物系統中表達蛋白質具有產量高、速度快、汙染少、可生產高分子量蛋白質等優勢，但蛋白質產物的化學組成相對受限。如果要引入非天然胺基酸或進行精確翻譯後修飾，化學合成的靈活性就高得多，然而化學合成蛋白質在目前仍然是一個十分複雜、耗時費力的過程。1963年，Merrifield發展了多肽固相合成法（SPPS），但是該方法合成速度慢且不適用於合成超過50個胺基酸的多肽。先前的研究表明，向反應器中加入固相載體並將其作為固定床運行，可以實現多肽的自動化和高保真合成（Tetrahedron Lett., 1970, 11, 4503–4505）。受此啟發，美國麻省理工學院的Bradley L. Pentelute教授（點擊查看介紹）課題組開發了一種自動化快速流動多肽合成（automated fast-flow peptide synthesis, AFPS）儀器（ChemBioChem, 2014, 15, 721–733; Nat. Chem. Biol., 2017, 13, 464–466），在90 °C下可快速合成包含30個胺基酸殘基的多肽，平均每個胺基酸殘基僅需短短40 s。合成速度上去了，但還要看到，人體中發現的大多數蛋白質長度都有約400個胺基酸，那麼這種策略能否用於合成更長的肽和蛋白質呢？

Bradley L. Pentelute教授。圖片來源：MIT

近日，Pentelute教授課題組在優化的AFPS方案下，在數個小時內以327個連續反應直接合成長達164個胺基酸的肽鏈。他們使用這種AFPS儀器，合成了九種不同的蛋白質，包括酶、結構單元和調節因子等。經過純化和摺疊後，合成蛋白質顯示出與生物表達蛋白質相當的性質和活性。相關成果發表在Science 上。

圖1. 自動快速流動固相肽合成的條件優化可實現長胺基酸序列的高保真合成。圖片來源：Science

關注X-MOL的讀者，在看到「自動化」、「快速流動」這些詞的時候，估計能迅速聯想到在合成界「乘風破浪」的流動化學（Flow Chemistry）技術。這項技術，除了被科學家用於搭建自動化合成系統，也受到了工業界的青睞。輝瑞公司將其用於自動化高通量化學反應篩選，每天篩選超過1500個反應條件，還同時支持數百微摩爾量級的合成，滿足後續生物活性測試的需求（Science, 2018, 359, 429, 點擊閱讀詳細）；禮來公司將其用於CGMP規範下的千克級藥用化合物製備（Science, 2017, 356, 1144, 點擊閱讀詳細）。所以，流動化學入選IUPAC評選的十項有潛能改變世界的化學創新（點擊閱讀詳細），算得上實至名歸。

回到這篇文章。首先作者對AFPS方案中的常規參數進行了優化（圖1B），包括流速、反應溶劑、試劑濃度、溫度和偶聯試劑。同時還研究了不同活化劑在偶聯步驟中的性能，從而確定了最佳活化劑——氮雜苯並三唑試劑PyAOP和HATU。鑑於天冬醯胺的形成是SPPS和AFPS中的主要副反應，因此作者篩選了各種脫保護基鹼、添加劑、天冬氨酸保護基，結果顯示較溫和的脫保護基鹼（哌嗪和HOBt與哌啶）和大位阻的天冬氨酸保護基（O-3-甲基戊基酯，OMpe）可以減少天冬醯胺的形成。然而，最有效的策略是加入甲酸作為哌啶的添加劑，並用二甲氧基苄基甘氨酸作為骨架保護劑。此外，作者在最終優化步驟中證實了具有高差向異構化風險的胺基酸（即半胱氨酸和組氨酸）的手性保持不變。如圖1C、1D所示，這兩種胺基酸的差向異構化隨激活時間和溫度而增加。事實證明，保護基的選擇對組氨酸至關重要。在60 °C下於較短的時間內用PyAOP活化Fmoc-Cys(Trt)-OH和 Fmoc-His(Boc)-OH，得到< 2％的D-異構體。在這些優化條件下，差向異構體的數量不會在多個偶聯循環中增加（圖1E）。在手動覆蓋N-端後執行100個胺基酸偶聯後，D-異構體的數量沒有變化，這表明半胱氨酸和組氨酸的差向異構化僅發生在激活步驟中。這使作者能夠固定普適的AFPS方案，然後將其用於合成超過50個胺基酸的序列。

圖2. 胰島素原和HIV-1蛋白酶的合成證明了AFPS優於傳統SPPS方法。圖片來源：Science

接下來，作者嘗試使用AFPS方案來合成胰島素原（86個胺基酸）和人類免疫缺陷病毒1（HIV-1）蛋白酶（99個胺基酸），結果顯示胰島素原和HIV-1蛋白酶的合成分別在3.5 h和4.5 h內完成，純化後可得到毫克級樣品。此外，作者比較優化的AFPS方案與傳統SPPS方法，結果表明優化的AFPS方案的產物純度更高，所用時間更短（圖2）。

圖3. AFPS可以在數小時內高保真地合成長胺基酸序列。圖片來源：Science

為了證明AFPS方案的普適性，作者合成了長度~70至~170個胺基酸的多種蛋白鏈（圖3A），其中包括藥物研發相關靶標（如HIV-1蛋白酶和MDM2）和可作為治療藥物的蛋白質（如FGF1和胰島素原）。通過合成含有定點突變的barnase和HIV-1蛋白酶的衍生物，證實了AFPS技術（與生物方法相比）能夠快速、更大量、更多樣化地引入非天然胺基酸。值得一提的是，所有肽鏈均在3.5 h至6.5 h內成功合成，並且每個合成過程中的主要產物均為所需的蛋白質，經HPLC純化後得到毫克級產物，足夠用於摺疊或評估三級結構和生物學功能（圖3B）。

化學合成的長鏈多肽或蛋白質，是否能正確摺疊並具有生物學活性是關鍵問題。隨後，作者通過分子排阻色譜法和離子交換色譜法對選定的合成蛋白進行了純化和摺疊，並通過生物物理和功能性質測定對其三級結構進行了表徵。結果表明，基於AFPS方案的合成蛋白的三級結構與功能與生物表達的重組蛋白標準品相當（圖4、圖5）。這說明AFPS方法的保真度高，可合成共價結構明確和手性保留的合成蛋白。

圖4. 合成的barnase和barstar摺疊成天然三級結構，並顯示出與重組樣品相當的酶活性。圖片來源：Science

圖5. 包含三個非天然胺基酸的合成HIV-1蛋白酶摺疊成天然二聚體結構，並顯示出與文獻樣品相當的酶活性和底物特異性。圖片來源：Science

總結

Pentelute教授課題組優化了AFPS方案，實現了長鏈多肽和蛋白質的自動化快速流動合成，可快速製備與重組表達蛋白質具有相當三級結構及生物學活性的單結構域蛋白質，從而大大提高了化學方法在蛋白質合成中的應用潛能。這不僅有益於蛋白質研究，特別是那些難以通過生物學方法製備的蛋白質，還可用於快速按需生產個性化的多肽和蛋白質藥物。

Synthesis of proteins by automated flow chemistry

N. Hartrampf, A. Saebi, M. Poskus, Z. P. Gates, A. J. Callahan, A. E. Cowfer, S. Hanna, S. Antilla, C. K. Schissel, A. J. Quartararo, X. Ye, A. J. Mijalis, M. D. Simon, A. Loas, S. Liu, C. Jessen, T. E. Nielsen, B. L. Pentelute

Science, 2020, 368, 980-987, DOI: 10.1126/science.abb2491

導師介紹

Bradley L. Pentelute

https://www.x-mol.com/university/faculty/621