第一作者：Jonathan B. Grimm
通訊作者：Luke D. Lavis
通訊單位：霍華德·休斯醫學研究院
1. 合成Si-螢光素
2. 合成Si-羅丹明
3. 氟代SiRh染料用於生物分析標記
螢光探針是生物學的重要研究工具。利用化學的手段調節螢光團的性質可將染料基於特定的應用場景進行微調。其中螢光素和羅丹明染料作為生物探針具有優異的性能1-2。氧雜蒽螢光探針被廣泛應用主要基於其兩個特性：高螢光的兩性離子形式和無螢光的內酯形式之間的平衡；通過拓寬共軛或氧原子的取代對光譜特性進行微調的能力。
其中矽取代的氧雜蒽類染料（SiFl, SiRh）被認為具有生物成像的巨大潛力3。與氧羅丹明相比，其光譜紅移了~100 nm。基於矽羅丹明優異的性能製備的螢光探針已經被用於顯微成像的前沿領域，如螢光標記、染色等。發展新型的SiFl和SiRh衍生物的一個顯著問題為現存的合成策略效率較低。
基於此，作者發展了一種新型的SiFl和SiRh的合成策略。在該策略中富電子的雙芳基金屬中間體與酸酐/酯進行反應生成中心C-C鍵（圖1）。所用的化合物6可以由相應的二溴化合物製備，較矽蒽酮的中間體更易獲得。
圖1 Si-螢光素和Si-羅丹明合成策略
要點1. 合成Si-螢光素
作者首先合成了SiFl，在鹼性條件下，其光譜出現了明顯的紅移（λmax = 579 nm, λem = 599），摩爾消光係數（ε = 93 000 M−1 cm−1）和量子產率高（Φ = 0.53）。該染料同樣顯示出了pH敏感型，pKa = 8.27。但該值較生理pH值高，限制了其在成像方面的應用。作者用該策略高效的拓展了一系列的氟取代矽基螢光素。該合成路線從化合物1出發，經過了5步，總收率為48%，與之前的合成方法相比，產率提高了8倍，反應減少了4步（圖2a）。
由於氟原子的存在，化合物24-26的光譜紅移了15-20 nm，全氟取代的化合物27的光譜進一步紅移了20 nm（圖2b）。最重要的是，氟取代對SiFl的pH敏感性具有顯著的影響，氟取代越多，pKa降低的幅度越大（圖2c-d）。
圖2 Si-螢光素的合成及特性
要點2. 合成Si-羅丹明
隨後作者探討了該合成策略是否可以應用於SiRh的合成中。與之前合成矽羅丹明的方法相比（11步，產率4.6 %），該方法僅需4步，收率提高了近10倍。為了研究該反應的普適性，作者選擇了一些含氨基的底物。每種二溴化物與鄰苯二甲酸酐或四氟鄰苯二甲酸酐結合時均具有良好的耐受性（圖3）。
由於在水溶液中SiRh染料的內酯-兩性離子平衡向閉環無色的形式移動，SiRh顯示出了較低的可見光吸收。為了進一步比較各種Si-羅丹明的摩爾消光係數，作者在酸性介質中進一步測試。四氟衍生物35的顯示出了20 nm的光譜紅移以及低的量子產率。但其在水介質中具有較大的摩爾消光係數(εwater = 112 000 M−1 cm−1)，與εmax (116 000 M−1 cm−1)相當。而四氯衍生物39顯示出了對內酯-兩性離子平衡更小的影響，其在光譜上有更大的紅移，但量子產率更小。JF646的2』，7』-二氟取代物32和36溶解性極差，分子在大多數溶液中以閉環的形式存在，導致了極低的摩爾消光係數。總之，用磺化作用、較小的雜環或氟修飾苯環可以穩定兩性離子以拓展矽羅丹明在細胞染色、標記等方面的應用。
圖3 用雙（5-氨基-2-溴苯）矽合成矽羅丹明
要點3. 氟代SiRh染料用於生物分析標記
作者發現苯環上滷素取代的氧雜蒽類染料可以直接與硫醇發生親核取代反應，這提供了一種便捷的修飾方式。如JF669(35)可以直接與市售的硫醇HaloTag配體反應，一步生成JF669-HaloTag配體61（圖4a）。
將U2OS細胞表達的Halo-Tag-histone H2B融合蛋白與61和Hoechst 33342共孵育觀察到了明亮的核標記螢光（圖4b-d）。用JF669-NHS(64)或AF660-NHS標記的二抗進行固定COS7細胞微管蛋白免疫標記，二者都顯示出了高效的免疫螢光標記的微管成像（圖4e-f）。且Si-羅丹明染料較AF660顯示出了更好的光穩定性（圖4g）。
本文提出了一種高效合成SiFl和SiRh的策略，即在二（2-溴苯基）矽烷中進行金屬/溴交換後，對酸酐/酯進行加成，從而在較少的合成步驟中獲得SiFl和SiRh，提高總收率。
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.7b00247
Legant, W. R.; Shao, L.; Grimm, J. B.; Brown, T. A.; Milkie, D. E.; Avants, B. B.; Lavis, L. D.; Betzig, E. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nat. Methods 2016, 13, 359– 365.
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王穎（wy_wjs@163.com）
吳鵬課題組博士研究生