【合成生物學】基於非正則輔因子的醛類化合物合成

2021-01-19 X-MOL資訊

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手性化合物是許多藥物、農藥和精細化學品合成過程中重要且有價值的中間體。對於手性藥物分子來說，不同的對映異構體在生物體內可能發揮不同的治療作用。因此，高光學純度的對映異構體化合物合成技術在不同領域中越來越受到關注。手性分子可通過有機合成或生物轉化的方法獲得。與化學催化法相比，利用酶或生物有機體的不對稱還原反應具有更多優勢，如安全、環保的反應條件，高反應產率，廣泛的底物範圍和較少的副反應等。儘管相關酶在不對稱合成手性化合物領域已取得了令人滿意的成果，但在大規模工業化應用方面仍面臨一個不可避免的挑戰，即各級中間產物易被宿主菌中充斥的NAD(P)-依賴型醇醛脫氫酶催化而流向副產物合成途徑。如何有效誘導反應系統中的碳源流向，是研究者們亟待解決的問題。煙醯胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 和煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP) 是生命過程中通用的氧化還原輔酶和重要的代謝物。NAD/NADP與各類醛脫氫酶相互作用存在著比較保守的分子識別模式，無論全細胞生物合成或利用細胞粗提液，異源合成途徑生成的醛均有可能被宿主菌中的脫氫酶還原為醇，這使得發酵產物組分複雜，且分離有難度，故宿主菌原有的代謝途徑和碳源流向需要重新規劃。相對於傳統的調節胞內輔因子水平、改造酶的輔因子偏好性及敲除競爭代謝等方法，近年來，加州大學爾灣分校的李晗團隊通過一系列工作構建了一種基於非正則輔因子 (Non-canonical redox cofactor)——煙醯胺單核苷酸 (NMN) 的氧化還原催化體系，並篩選出了NMN-依賴型葡萄糖脫氫酶突變體GDH Ortho (Black et.al., 2019)，它們的活性與天然系統正交，通過酶偶聯反應可實現NMN的循環再生。在胞內建立途徑專一的氧化還原驅動力，可以使目標產物香茅醛 (citronellal) 的合成途徑從大腸桿菌氧化還原系統中隔離 (如圖1)。經過多輪針對反應物製備過程及反應條件的優化，研究人員使香茅醛在細胞粗提液和全細胞合成中的轉化率分別達到了97-100% 和 83%。

圖1. (A) 香茅醛在粗提液及全細胞合成中的系統設計和反應方案。(B) 使用天然輔酶NAD(P)作為反應輔酶時, 宿主菌內醇脫氫酶(ADH)將中間代謝產物還原為對應醇，副產物增加。(C) 香茅醛合成途徑使用NMN作為唯一輔酶時，宿主菌內醇脫氫酶無法使用該途徑中間產物，目的產物轉化率顯著提高。重組大腸桿菌利用假單胞菌XenA (Xenobiotic reductase) 達到兩種在大腸桿菌中極易被還原的醛之間的轉化，由反應結果來看，不同輔因子存在時XenA均可催化檸檬醛 (Citral) 發生加氫反應。當使用宿主菌內源輔酶在細胞粗提液中進行合成時，由於反應物和產物均被還原成醇類，目的反應無法發生。而引入非正則輔酶NMN循環系統後，因胞內累積的還原型輔酶NMNH無法被其他醇醛脫氫酶消耗，該濃度梯度促進了XenA參與的合成反應，並阻斷了底物向其他代謝途徑的流通，使目的產物轉化率升到60%。在進一步應用於全細胞生物合成的過程中，實驗組僅對參與NMN循環的代謝途徑進行優化，使醇副產物的轉化率從60%降至接近0。這主要得益於利用NMN的外源代謝途徑與宿主菌內源代謝途徑相互獨立，使設計和構建高效、受控的物質轉化途徑成為可能，且對於在難以預測或複雜生物系統中構建人工代謝途徑具有重要意義。Aldehyde Production in Crude Lysate- and Whole Cell-Based Biotransformation Using a Noncanonical Redox Cofactor SystemKelly N. Richardson, William B. Black, Han Li*ACS Catal., 2020, 10, 8898–8903, DOI: 10.1021/acscatal.0c03070



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