GB 4789.4-2016沙門氏菌血清學鑑定經驗分享

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　　沙門氏菌是主要腸道病原菌之一，根據O及H抗原組成不同分為不同的血清型，目前已發現2500多個血清型，絕大多數血清型可引起人類疾病,其中傷寒、副傷寒沙門菌可引起傷寒、副傷寒,其他沙門菌血清型主要引起人類腹瀉或食物中毒事件,統稱非傷寒沙門菌。該菌通過汙染食物,主要是動物性食品傳播,故被列為食源性疾病。

　　目前,沙門氏菌是全球範圍導致急性食源性疾病的首要因素。在《中華人民共和國傳染病防治法》中將傷寒和副傷寒沙門氏菌感染列為乙類傳染病，而非傷寒沙門氏菌列為丙類傳染病中其他感染性腹瀉。乙類和丙類傳染病在管理和防控上有許多差別，為了節約管理和防控人力成本、減少不必要的浪費，準確鑑定沙門氏菌血清型尤為重要。在GB 4789.4-2016標準中，將血清鑑定分為多價血清鑑定和血清學分型，主要談談我們在實際工作中的一些做法。

　　一、 試劑耗材的準備

　　一次性滅菌平皿（7cm和9cm）、檯燈、診斷血清（寧波天潤60種）、黑底臺面、吸尖（200μL、10μL）、10μL移液器、營養瓊脂（北京陸橋）、Swarm agar瓊脂（北京陸橋）、0.85%鹽水。

　　1. 一次性滅菌平皿：7cm用於菌株的鞭毛復甦培養，因瓊脂高度要求至少達到平皿合起來時，直徑大一點的平皿的切線以上，如圖1。保證菌株生長所需要的營養條件，這樣可以比用9cm平皿節約瓊脂用量，平皿直徑小也有利於操作，不影響菌株的生長及後續試驗。9cm用於代替玻片做血清凝集試驗。如圖2。

　　2. 檯燈：提供近距離的光源。如圖3。

　　3. 診斷血清：國產的有寧波天潤、天津生物晶片，國外的有丹麥SSI、泰國S&A、日本生研、美國BD，如圖4。一般的檢測室，寧波天潤就能滿足日常需要，我們實驗室就是用寧波天潤沙門氏菌血清鑑定60種。

　　4. 黑底臺面：這個很重要，用於觀察血清是否凝集的結果，提供黑色背景。若實驗室臺面或牆面是黑色的就可以忽略這條。如圖5。

　　5. 吸尖和移液器：用於加入血清和挑取菌落的。可能大家會問血清瓶子上帶有滴管，還要用移液器加嗎？用滴管加血清有點浪費，移液器加3μL就足夠了，大家都知道血清還是比較貴的，而且1瓶血清也就1ml，如果檢測量比較大，很快就會用完。移液器加入血清可以保證每次加入的量準確，也可以節約使用血清。200μL的吸尖是用於挑取菌落的。為什麼用吸尖不用接種環？因為吸尖比較短、也不會彎曲，特別是在挑取軟瓊脂中的菌落時不會將瓊脂挑出。如圖6。

　　6. 營養瓊脂和Swarm agar瓊脂：生產廠家均是北京陸橋，營養瓊脂用於菌株的純培養及純培養後O抗原的凝集。Swarm agar瓊脂用於鞭毛復甦和位相變異試驗。如圖7。

　　7. 0.85%生理鹽水：川東化工，實驗室自配，用於血清學鑑定的陰性對照，檢查菌株是否有自凝性。如圖8。

　　二、 操作步驟

　　因腸桿菌科中有許多菌的抗原和沙門氏菌的O抗原之間存在交叉凝集反應，在血清鑑定之前，該菌株生化鑑定必須要符合沙門氏菌，生化不符，血清凝集結果肯定存在問題。提前一天將需要鑑定的菌株接種到營養瓊脂平板上。

　　（一） O血清凝集方法

　　1. 首先排除自凝集反應, 吸取3μL生理鹽水, 用槍頭挑取營養瓊脂中的單個菌落，在上述滴加了血清旁邊輕觸幾次，將多餘的菌刮掉，再將槍頭上佔有少許的菌體與生理鹽水混合,使成為均一性的混濁懸液,將平皿輕輕搖動30s~60s,在黑色背景下觀察反應,若出現可見的菌體凝集,即認為有自凝性,反之無自凝性。如果發現自凝，這個菌株不能進行分型。

　　2. A~F多價O血清凝集方法：將上述生理鹽水換成A~F多價血清，重複上述操作，觀察凝集情況，並做好記錄，如圖9；

　　3. A~F多價血清凝集者，依次使用試劑盒中O因子單價血清按照上述方法繼續凝集；

　　4. 小技巧使用O因子單價血清凝集時，首先選用平時常見的O因子單價血清，可以提高血清凝集效率。比如鼠傷寒沙門氏菌O4、腸炎沙門氏菌O9等。

　　5. 若A~F多價O血清不凝集時，應進行Vi抗原的凝集，具體操作見GB 4789.4標準。若Vi抗原也不凝集，需要考慮生化試驗是否準確，確定生化試驗沒有問題，就可能是非A~F群沙門氏菌，要使用含有其他群的血清試劑盒。

　　（二） H血清凝集方法

　　1. H 抗原的復甦：將鑑定了O血清的單個菌落點種（將接種環接觸Swarm agar瓊脂平板表面5s，不要用力壓瓊脂，也不要反覆點壓瓊脂）到Swarm agar瓊脂平板的中間，36℃培養6-8小時；O因子血清已確定的菌株也可以馬上進行H抗原的鑑定，效果肯定沒有復甦後好。

　　2. 培養6-8小時後，先凝集H多價血清，再凝集H單價血清，操作同O因子血清，應挑取Swarm agar瓊脂上擴散到邊緣的菌苔；

　　3. 若H血清均無凝集，重複第一步操作復甦H抗原2-3次；

　　4. 若只凝集出了H血清一相，且該菌非單相菌，應做位相變異試驗；

　　（三） 位相變異試驗

　　GB 4789.4-2016標準中有3個方法，即：簡易平板法、小玻管法、小倒管法。建議使用簡易平板法。將冷卻至46℃Swarm agar瓊脂倒入7cm平皿，加入上述凝集的H相血清2~3滴，混勻，待凝固後，點種相應的菌株，培養後，進行血清凝集試驗。

　　位相變異試驗成功的關鍵是要使用軟瓊脂培養基，培養基太硬點種的菌株不易擴散，如圖10；培養基太軟點種的菌株又會生長到培養基內部，凝集試驗操作時，挑取不到菌苔或是將瓊脂挑出，如圖11。

　　標準中規定是使用0.35%~0.4%半固體瓊脂平板，將各個廠家的半固體瓊脂平板做了位相變異試驗的比較，還是Swarm agar瓊脂最好用。如表1。

　　不擴散的情況：也有可能是該菌株鞭毛髮育不全，需要反覆傳代讓其鞭毛復甦，這隻討論瓊脂較硬問題。

　　以上就是我在做沙門氏菌血清學鑑定中的一點經驗，若有不當之處，請批評指正。

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