前情回顧：
「話說在生命科學這個大江湖，活躍著一支江湖人稱「結構生物學」的大家族。這裡臥虎藏龍，族人們各個身懷絕技，為解讀複雜生命過程的分子機制苦練武功。
欲知前情，請參考連結：
結構生物學三兄弟 & 小么妹的故事（引言）——Integrated Structural Biology。
結構生物學三兄弟 & 小么妹的故事（第一回）——NMR v.s. BioSAXS
今天，我們來聊一聊結構生物學三兄弟中的二哥——生物大分子晶體學（Macromolecules Crystallography, MX)遇到初出茅廬的生物小角散射（Biological small-angle scattering, BioSAS)這位小妹妹，兩者又會發生何種化學反應。。。。。。」
提到MX與BioSAS的組合，或許第一次聽到時您腦海中浮現的畫面是這樣的。
其實MX這位二哥與BioSAS小么妹才是血濃於水的至親。兩者的遺傳密碼上都烙刻著著名「布拉格（Bragg）方程」的印記。從本質上講，MX與BioSAS都是通過研究生物活性物質對輻射源（包括X-射線、中子、電子）的散射來解釋生命現象的科學研究工具。兩者的區別在於：
MX是一種特殊的散射，科學上稱之為衍射（diffraction）。主要利用生物大分子晶體內部規則的晶胞排列對輻射源的衍射效應，進行晶體相位分析以及結構分析，開展針對生物大分子的三維結構研究；
SAS是發生在生物大分子受輻射源照射後原光束附近小角度範圍內的電子相干散射現象，源起於樣品內部電子密度的均方起伏。根據相干散射強度信息的散射矢量範圍（scattering vector, q = 4π sin(θ)/λ），可以通過香農-奈圭斯特（Shannon-Nyquist)採樣定理，獲得目的生物分子的最大分子粒徑（maximum dimension, Dmax)。進而以Dmax作為限定因子，採用從頭計算（ab initio）的方法，獲得目的生物分子低解析度的三維結構。
滴血認親之後，二哥MX與小么妹BioSAXS決定強強聯手，相互支持，積極尋求合作共贏。兩者當下舉辦了一場懇切坦誠的家庭會議，並達成如下共識：
BioSAS小么妹可以提供檢測體系的整體形貌參數，同時適用於多結構域體系與高延展性體系；她的獨門絕技就是不受檢測體系分子量限制，而且可以進行高通量、大規模、快速的反應條件篩選；但她也有自己的技術短板——就是檢測解析度不高，只能達到1-2nm解析度。
MX這位二哥可以提供與生物功能相關的生命物質高解析度的精準三維結構。對與人類健康、疾病和醫藥研發相關的重要生物膜蛋白、生物大分子複合體結構-功能研究具有重要的推動作用。當然二哥也有技術短板——就是檢測體系必須是能夠形成規則晶胞排列的晶體。要知道長晶體這件「小」事有可能是一個結構生物學博士生心中永遠的痛。
話說促成這場強強聯手江湖對話的幕後推手，要特別感謝更高亮度先進光源的建成、超高信噪比單光子計數X-射線探測器的問世以及便捷的數據分析處理程序開發三元大將。讀到這裡，我想大家應該對本場出鏡的主要人物已經有了大致了解。接下來我們就一起來看一下高手聯盟，是如何取長補短，互相助力，解決具有重要生物學意義結構生物學問題的吧。
1. 驗證已解析原子分辨模型的準確性 （Model Validation）
以分子量為14.4 kD，迴轉半徑為14.5 埃的商業化標準蛋白——雞蛋清溶菌酶（Lysozyme）為例，在PDB資料庫中可以搜索到兩條對應lysozyme的PDB entry，分別為193L以及1E8L。將兩者的原子分辨結構通過計算的方法轉化為理論散射曲線（193L為紅色；1E8L為綠色）後，分別與lysozyme的實驗散射曲線（黑色）做比對，發現其實PDB編號為193L的結構更符合lysozyme的溶液生理結構。有效排除了蛋白晶體生長條件引入的錯誤摺疊構象。你知道嗎？目前蛋白質晶體結構解析相關投稿文章，審稿人通常都會要求提供晶體結構與對應生物分子溶液小角散射數據的一致性比較數據。
2. 基於散射數據的剛體建模 （Rigid-body modelling）
以具有部分柔性結構的多結構域蛋白剛體建模為例。基於多結構域蛋白溶液散射數據重構的低解析度envelope，利用BUNCH，CORAL，SASREF等程序，可以將已解析原子解析度結構的各結構域很好地重構出來。其中沒有電子密度的柔性結構，可以通過ab initio方法以虛擬粒子（Dummy residues）的形式補全缺失結構，並很好地與已知原子解析度結構手拉手，重現溶液狀態下生物分子的生理活性結構。
3. 基於單體原子結構分析自組裝體系生物分子溶液的寡聚狀態 （Rigid-body modelling）
以上海交大醫學院蒙國宇研究團隊對PML-RING聚合體系的研究為例。該團隊利用X射線晶體衍射技術成功解析出PML-RING結構域的四聚體結構。同時發現PML-RING聚合體在溶液生理狀態下是多種聚合形式的混合物。基於該體系溶液散射數據和已解析的原子解析度結構，研究團隊很好地揭示了PML-RING聚合體在生理狀態下分別以單體、二聚體和四聚體的聚合狀態存在；並在此基礎上鑑定了各寡聚狀態在溶液生理條件下的存在比例。
4.基於散射數據和已知原子分辨結構分選混合溶液體系中的多種構象 （Multiple well-defined conformations）
以與古細菌分泌相關的ATP酶GspE為例，該ATPase在溶液狀態下是由單體組成的六聚體，該六聚體具有「open」、「close」以及不完全open三種構象，在溶液中以三種構象的混合形式存在。Yamagata & Tainer課題組基於該六聚體單體的原子結構，採用計算生物學方法，分別擬合了Mg2+/AMP-PNP共孵育GspE溶液散射曲線以及ADP共孵育的GspE散射曲線，得到了GspE在ADP處理實驗組中三種構象混合的比例。
5.基於散射數據研究具有無序結構的生物大分子（Conformational disorder）
許多具有重要生物學功能的生物大分子多結構域蛋白都具有一定的柔性結構，這些分子含有的柔性結構賦予多結構域蛋白更多的空間構象，因此，此類生物大分子通常很難通過結晶的方法解析結構。針對此類體系，基於溶液散射數據給出的平均構象可以更好地表徵其生理活性結構。以酪氨酸激酶c-Abl蛋白結構表徵為例。該蛋白的N端由三個結構域組成，各結構域之間由柔性胺基酸鏈相連。如果c-Abl十八烷基化的N端結合到了蛋白的活性結構域中，該蛋白就會呈現自抑制狀態。Nagar所在的課題組採用SAXS的方法證明了c-Abl的突變體具有更加延展的結構，且基於CREDO方法構建的多構象延展結構可以更好地擬合實驗散射曲線，說明c-Abl中的柔性結構賦予蛋白的多構象在其發揮生物學功能過程中具有重要的意義。
此外，隨著整合結構生物學平臺的建立，MX和SAS技術的融合可以藉助更多生物物理結構生物學表徵方法，進而針對更複雜的體系（如：膜蛋白、完全無序蛋白以及生物大分子複合體）開展更多有意義的工作。
如同半個世紀前白人與黑人握手言和的那場「Centrary Hand-Shake」為美國帶來了長達幾十年的經濟繁榮和發展; 結構生物學科經過半個多世紀的耕耘，也到了技術交叉融合，協同發展的收穫季節。在這場結構生物學的歡宴中，相信BioSAS小么妹做出的貢獻一定會越來越重要。
Reference:
Andrew.B.W et al. (2013). SCIENCE 339, p913-915.
Yamagata.A., & Tainer, J.A. (2007). EMBO J. 26, p878-890
Nagar. B.., et al. (2010). Cell 112, p859-871
Pillon. M.C., et al. (2017). Biochim Biophys Acta Proteins Proteom.11 -p1623-1630
Trewhella. J. (2016) Curr Opin Struct Biol 40 p1-7