化學交聯質譜讓結構生物學研究如虎添翼

 

 

在蛋白質組學分析方法中，質譜獲得的是多肽序列結構的信息；那麼用質譜是否可研究大分子蛋白的結構信息？近幾年來，董夢秋實驗室在中國做出了多項先驅性工作，主要集中在化學交聯質譜領域。在用單顆粒冷凍電鏡技術研究結構生物學屢創佳績的當下，很多研究者都把樣品一分為二，一份做冷凍電鏡，一份做交聯質譜。那麼交聯質譜如何讓結構生物學研究如虎添翼？

pLink和交聯質譜在國際上的影響力

與化學交聯質譜的結緣

董夢秋曾在著名蛋白質組學大師John Yates教授實驗室做博士後，Yates教授最享譽全球的工作是開發了SEQUEST蛋白質組學「鳥槍法」鑑定軟體。當時，有位合作者研究一種HSP90的複合體，認為其結合方式同以前報導的不同，希望能用化學交聯質譜（CXMS）判斷複合體中兩個蛋白的結合界面。那時只有常規肽段鑑定工具，董夢秋用18O標記區分交聯肽段和普通肽段，通過大量搜索和輔助人工判斷，終於完成了任務。雖然研究很有意思，但因為沒有專用軟體工具，做起來很費勁。

董夢秋2007年到北京生命研究所（NIBS）做PI，找到了中科院計算所賀思敏教授，從此董夢秋開始了與pFind 團隊的長期合作。他們致力於開發交聯質譜技術，打造出已經成為業界標杆的pLink軟體和一系列工作流程。

交聯質譜的價值

董夢秋談到，「近年來質譜技術在結構生物學領域的重要性愈發彰顯。現在結構生物學家研究的蛋白質複合體越來越大，種類、狀態越來越多，即使有強大的電鏡和晶體學手段也不一定能看清所有的關鍵性的結構細節、狀態間的差異，或者不能確定組成亞基的化學計量比，他們的需求帶動了交聯質譜、native MS和氫氘交換等技術的應用和發展。看看結構文章的作者名單就知道，很多都有質譜專家的身影。」

董夢秋實驗室和pFind 團隊的合作開展不到一年，Ruedi Abersold團隊就在Nature Methods上發表了他們開發的交聯質譜鑑定軟體，但該軟體有一個明顯的缺陷：沒有假陽性率的估算，無法判斷鑑定結果的好壞。2012年董夢秋實驗室和pFind團隊合作開發的pLink軟體在《Nature Methods》發表。在這項工作中快速尋找候選肽、譜圖打分、評價、控制假陽性率等環節一步到位。該軟體和配套的方法流程還有一大好處：不要求必須使用穩定同位素標記的交聯試劑，僅需使用便宜上千倍的普通交聯試劑。迄今，pLink在全球有800多個用戶，被眾多新開發者當作CXMS軟體的業界標杆來比較。

交聯質譜讓結構生物學研究如虎添翼

質譜研究結構生物學的方法

在介紹交聯質譜前，董夢秋為我們普及了用質譜研究結構生物學的方法。在當今的結構生物學研究中，冷凍電鏡是主力。從單顆粒冷凍電鏡圖像中把形態相近的顆粒挑出來進行對齊、平均、三維重構，可以得到高分辨度的電子密度圖，然後搭建蛋白質複合體的結構模型。可是，蛋白質柔性區域的結構無論用電鏡還是晶體學技術都很難看清楚，甚至完全不可見，這樣建模的時候會遇到斷頭路，往下接到哪兒是個問題。交聯質譜數據告訴我們，兩個被交聯的胺基酸殘基空間距離不會超過某個上限。有了足夠多的交聯距離約束信息後，我們就可以把斷頭路接起來，並推斷出柔性區的位置和分布方式。目前很多結構生物學實驗室在製備冷凍電鏡樣品時會分出一部分做交聯質譜，後期匹配兩種數據以獲得更完整的結構。而Native MS（非變性質譜）可以提供蛋白質複合體組成亞基的化學計量比，幫助搭建合理的結構模型。Foot Printing（足跡法）用化學試劑標記暴露在環境中的胺基酸殘基，酶解後可用質譜檢測被修飾的肽段，從而了解哪些胺基酸分布在蛋白質的外表面以及蛋白質形成複合體後被包埋的區域。交聯質譜數據中的mono-link肽段（交聯劑一端與肽段共價連接，另一端水解而形成的修飾單肽）也可以提供同類信息。氫氘交換不受化學修飾試劑的選擇性限制，可以做得更精細。

交聯質譜的基本原理

研究蛋白質結構與相互作用的傳統技術，如核磁共振技術、X 射線晶體衍射技術等，對於蛋白質的純度、結晶性和絕對量均有比較高的要求，限制了其廣泛應用。化學交聯結合質譜技術(chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry)，簡稱交聯質譜技術、CXMS或XL-MS，是近年發展起來的新方法。它利用化學交聯劑 (chemical cross-linker) 處理蛋白質樣品，將空間距離足夠接近、可以與交聯劑反應的兩個胺基酸以共價鍵連接起來，然後利用基於高精度質譜的蛋白質組學手段分析交聯產物。交聯反應發生在溶液態，反映了蛋白的溶液構象。

交聯蛋白質酶切後產生的交聯肽段的各種形式

交聯蛋白質酶切後可以產生三種交聯產物（如上圖）：a．被交聯劑修飾的單肽 (交聯劑只一端交聯一條肽段，mono-linked peptide)，Type-0 類型的交聯肽段；b．肽段內部交聯 (交聯劑兩端交聯同一條肽段，loop-linked peptide 或intra-linked peptide)，Type-1類型的交聯肽段；c．肽段間交聯 (交聯劑交聯兩條肽段，Inter-linked peptides)，Type-2 類型的交聯肽段。其中，最有用的是Type-2類型。

交聯質譜的應用實例

第一個例子，同UCLA一個實驗室合作研究mTORC1激酶複合體以何種方式募集底物蛋白4E-BP1（J Biol Chem. 2014 Feb 21.）。mTORC1激酶複合體由mTOR、Raptor和LST8三個蛋白組成。有人認為募集4E-BP1的是mTOR，也有人認為是Raptor。mTORC1與4E-BP1的交聯質譜結果表明只有Raptor N-端的第一個RNC結構域同4E-BP1間有交聯。

用交聯質譜揭示Raptor和4E-BP1的作用界面信息

依據交聯結果的距離約束信息構建結構模型，再用肽段競爭實驗進行生物學驗證，可以確認交聯質譜結果可靠，mTORC1複合體中的Raptor亞基招募了4E-BP1。 如上圖所示，Raptor兩個α-螺旋(α-helix) 形成的「基座」與4E-BP1肽段（紫色）結合

第二個例子，同NIBS一個遺傳學實驗室合作，研究裂殖酵母中兩個水解酶APE2和LAP2是如何通過一個叫NBR1的蛋白運送到溶酶體中的（Mol Cell. 2015 Sep 17.）。利用交聯質譜發現APE2是關鍵，因為另外兩個蛋白都與它的N末端有交聯。去掉APE2 N端的5個胺基酸後再做實驗並用螢光標記，證實了該結果。沒有這些N端的關鍵胺基酸結合位點，就不能形成三元複合體，兩個水解酶都無法進入溶酶體中。

Nbr1、Ape2和Lap2的結合

在第三個例子中，交聯質譜與冷凍電鏡技術結合，解析核糖體前體的組裝過程（Nature， 2016，細胞核內的核糖體組裝前體結構揭示了裝配成熟因子的功能多樣性），合作者是清華大學高寧教授。核糖體前體在加工過程中，有很多組裝因子（Assembly factor）蛋白參與，組裝任務完成後它們被去除。比如，有很多組裝因子結合在pre-60S核糖體前體的ITS2區域，但它們的結構未知（不知道積木塊兒長什麼樣），不能用搭積木的方法歸屬該區域的電子密度。通過二級結構搜索，比如把電鏡看到的長長短短的α-螺旋與二級結構預測的α-螺旋進行比對，找到部分肽段的位置，再加上交聯質譜信息一點點推斷、確認，最後全部解析這部分結構。

用冷凍電鏡+交聯質譜揭示核糖體組裝前體結構

第四個例子是同清華大學王宏偉教授的合作研究（J Mol Biol.， 2017）。WHAMM蛋白的作用是沿著微管鋪就的軌道運送囊泡（vesicle）。它一端結合囊泡，另一端結合微管。與微管結合後，WHAMM的微管結合域 (MTBD) 在冷凍電鏡中只能看到被稱為MBM（Microtube Binding Motif，圖中用紫色表示）的一小部分，它與微管緊密結合；其餘部分（圖中用黃色表示）因為高度靈活（flexible），所以電鏡無法看清。通過交聯質譜發現， MBM（紫色部分）在沒有結合微管時與MTBD的其它區域（黃色）有大量交聯，但結合了微管後就看不見了。該結果與冷凍電鏡結果互補，啟發我們得到一個合理的解釋，即MTBD結合微管前後發生了巨大的構象變化，MBM與MTBD的其餘部分原本緊挨著，一旦結合了微管兩邊就分開了，而且相互之間可以隨意擺動。

用交聯質譜揭示WHAMM和微管結合的、冷凍電鏡看不清的Flexible區域

交聯質譜還可以鑑定體內天然發生的一些交聯，如二硫鍵。關注蛋白質藥物研發的生物製藥公司有很多這方面的需求。交聯質譜還可以表徵蛋白質動態。董夢秋實驗室與武漢物理與數學研究所唐淳實驗室合作在JBC發表題為「Modeling protein excited-state structures from "over-length" chemical cross-links」的研究論文，成功開發了基於交聯質譜的研究蛋白質動態 (protein dynamics) 的新方法，並發布了通用流程。通過交聯數據和結構計算發現，結合了鈣離子但沒有結合配體肽段或蛋白的鈣調蛋白（Ca2+-CaM） 除了採取啞鈴狀的開放態構象（基態），還有一種閉合態構象，非常接近之前用NMR手段觀察到的激發態構象。(生物谷Bioon.com）

 

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