由於沒有考慮到使用一些可以替代的辦法，目前還有七種傳統做法仍然存在於HPLC的技術應用中，而這些做法其實非常不利於HPLC技術的效率提高、運行成本的降低以及運行時間的縮短。本文中我們將提出一些可行的傳統做法的替代方法，有些人可能會對這些替代方法出現爭議，但如果應用得當的話，這些替代方法勢必會產生顯著的效果。因為相比不停地機械勞作，分析科學家應該更聰明地工作。
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常見錯誤之一——色譜柱都用粒徑5µm的顆粒填充
回想一下，多年來標準HPLC分析柱（250mm×4.6mm）都是採用5µm 粒徑顆粒填裝的，然而，事實上3µm 粒徑顆粒填裝的色譜柱（150mm×4.6mm）具有更好的分離效果及更短的分析時間。同時，現在許多實驗室標配的色譜儀是超高壓液相色譜（UHPLC）和液相色譜-質譜（LC-MS），所以色譜柱更應該換成3µm 或sub-2µm 填裝的色譜柱。
然而，值得注意的是：3µm 粒徑顆粒填裝的色譜柱進口孔隙更小，更容易被「髒」的樣品堵塞。
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常見錯誤之二——分析色譜柱以4.6mm內徑為標準（1mL/min）
自20世紀70年代初，HPLC分析柱的「標準」內徑就已經是4.6mm了，而近年來，在努力減少溶劑消耗、節約樣品的目標下，許多實驗室已經開始將3.0mm內徑的色譜柱作為更好的選擇，來代替使用4.6mm內徑色譜柱了。如果使用現代的中間分散HPLC儀的話，柱率和柱外頻帶展寬的效果通常不會受到任何負面影響。總之，使用較小內徑的色譜柱是有利的，在梯度洗脫條件下可以獲得更高的解析度。
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常見錯誤之三——對HPLC的流動相都進行過濾
通常經淨化系統所得的HPLC級溶劑和水已經足夠乾淨了，如果我們再給它一次額外的過濾，那只會適得其反，引入不必要的化學汙染。事實上，許多實驗室都有自己的一套色譜儀器保養維修計劃，每年對HPLC系統中的過濾器進行更換，所以我們沒有必要再對流動相進一步過濾。
例外的是：如果你使用的是離子對試劑、低純度緩衝劑或高鹽含量的流動相時，仍然強烈建議你對流動相進行過濾。
還有一種情況是有必要進行額外過濾的，即如果由於水源的質量不好或者其他原因導致從淨化系統流出的水不夠乾淨的時候。
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常見錯誤之四——使用緩衝劑流動相
當分析酸性或者鹼性分析物的時候，有必要對流動相進行酸化或者鹼化。簡單的流動相如含0.1％（體積比）甲酸的水溶液，僅需要將1mL甲酸定容到1升水中即可迅速製備。同樣，含0.1％（體積比）氨的水溶液可以用於多種高pH值兼容柱。當使用低矽羥基活性柱時，無論用低還是高pH值流動相運行，緩衝劑其實都很少用到，包括以流動相A為稀釋劑配製進樣樣品溶液時。
例外的是：當分析複雜分子、複雜混合物時，可能仍然需要用緩衝劑流動相，以保持高的選擇性和特別適中的pH值的流動相。
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常見錯誤之五——每次試驗都重新配製新的參考標準溶液
在藥品的質量控制實驗室中，往往每個試驗都會重新配製新的參考標準溶液，實際上這是沒有必要的。許多藥物在低溫和適當的貯存條件下溶液具有足夠的穩定性。所以你可以一次性配製幾百個合格的參考標準溶液置於HPLC小瓶中，然後冷藏或冷凍貯存供以後分析用。而對於試驗結果的長期穩定性研究來說，更應該採用由同一個原始溶液配製而成的標準溶液。當然，對於通常的試驗，標準溶液的儲存條件下的穩定性（保質期）是應該經過驗證的，並記錄首次配製時間。這裡值得我們注意的是：所有的操作都需要做好記錄。
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常見錯誤之六——對樣品瓶進行搖動
搖動（或反轉）樣品瓶會在樣品瓶蓋下面形成一層液體膜，這會對HPLC自動進樣器造成幹擾以至於給出一個混亂的試驗結果。所以即使在排除了故障的情況下，也要始終警惕這一點。
例外的是：如果樣品是冷凍過的，那麼解凍後，需要進行渦旋或搖動以確保樣品均勻。
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常見錯誤之七——使用不鏽鋼卡套作為柱的接頭
HPLC系統通常安裝有不鏽鋼接頭和套圈，大多數情況下它們工作得都很好，但是它們不適合用於需要頻繁更換色譜柱時的連接。
首先，不鏽鋼卡套只能與為其量身定製的端部管接頭相匹配，而對於不同的色譜柱來說這種「量身定製」只會適得其反。
其次，預製的不鏽鋼接頭只能夠重複密封5-10次。當某些製造商的不鏽鋼接頭用於其他品牌的色譜柱時，由於不同端部接頭和插入深度的關係，這個問題會變得尤其明顯。
一個可能的解決方案是使用可以用手指擰緊的聚醚醚酮（PEEK）管件，它們價格低廉，並且在5000psi（34.47MPa）壓力下的密封效果也很好。許多較新的UHPLC接頭，其額定壓力為20,000psi（137.9MPa），只需用手指擰緊，然後用扳手再轉四分之一圈就可以了。
譯自：chromatographyonline
來源：材料與測試
譯者：cynthia
PS：附贈色譜柱保護的幾個步驟。
不要未處理樣品就進樣
在我的LC課堂中，我經常開玩笑的說，延長柱子壽命的最好方法是不要打開色譜柱的盒子。一旦你開始進樣，就開始了柱子走向滅亡的道路。樣品有兩個主要方面可以影響色譜柱—化學性質和物理性質。我們把樣品中不要的化學汙染物和微型顆粒清除的越好，柱子的壽命就越長。使用SPE(Solide-Phase extraction)，液液萃取和其他技術來除去化學汙染物是LCGC中「Sample Prep Perspectives」專欄常有這樣的文章，我就不在這裡多說了。一言以蔽之，越多的樣品前處理，越少的化學汙染物進入色譜柱，柱子壽命就越長。你還得平衡一下樣品前處理費用和它帶來的好處。比如，你買了柱芯和試劑，並加上你投入時間的費用，你在每個樣品上SPE的花費會很容易超過5美元，這是可以承受500次進樣量的反相柱在每個樣品分析上分攤成本的5倍多，這差不多需要將色譜柱進樣次數從500次延長至2500次才扯平了。另一方面，如果沒有做過任何處理的血漿樣品直接進樣了，柱子可能就只能進樣10次左右。你也要考慮到當更多的樣品處理步驟加入的時候的數據質量。我知道，在我們的實驗室中，這些措施可以讓我們在低濃度的時候收集到有用的數據並得到一致的結果，而不是比較少的前處理步驟可能得到的結果。
不論你做沒做其他前處理步驟，幾乎所有的樣品都會從樣品過濾，離心或者兩者中得到好處。樣品經過一個一次性的過濾膜過濾來移除可能堵住柱子進口篩板的細顆粒物。濾膜的孔徑不能大於柱子進口篩板的孔徑。大部分>3μm填料顆粒的柱子用2μm孔徑的篩板，3μm填料粒徑的柱子則一般用0.5μm的篩板，填料粒徑<3-μm的柱子，比如UHPLC，一般用0.2μm的進口篩板。最常用的樣品過濾膜是0.45μm孔徑的，這個對除了亞2μm之外的其它柱子都已經足夠，亞2μm柱子，則需用0.2μm的濾膜。濾膜可作為預裝在一次性注射器中的柱芯，也作為96孔板的過濾板。即使這些過濾裝置一般是有效的，但我不是非常強烈的推薦使用。至少有4點使我不同意過濾樣品。第一，樣品過濾成本比較昂貴，上一次我比較過價格，一次性購買1000份，每份的價格都要高於0.5美元，-這個與柱子在每次分析中的分攤費用幾乎一樣。第二，用0.5μm濾膜過濾很慢，而0.2μm濾膜則更慢。第三，如果你在一個監管嚴格的環境中工作，每一個樣品的處理步驟都必須一樣，這就是說，如果你過濾了一個樣品，那麼其他剩餘的樣品也都要過濾，無論實際上需不需要。最後，如果你要驗證你的LC方法，就需要驗證所有的過濾步驟。在過濾的過程中，樣品會有損失—如果50μL樣品經過濾膜，得到的樣品就少於50μL。你得證明樣品不是選擇性的損失，特別是在高或者低濃度的時候。因此，我們可以看到，樣品過濾是需要花很多功夫和金錢的。但是你要是不怕麻煩和不要求成本，樣品過濾是在大部分的情況下都是能提高柱子的壽命的。
樣品過濾的一個替代方法（或者是補充）是在進樣之前離心。這是一個簡單又相對便宜的方法。只要把樣品放進離心管，Eppendorf 離心管或者一個96孔的離心板，再放到小型臺式離心機裡，調整轉速到其最大速度，旋轉5-10min。這會使會引起篩板堵塞的顆粒沉積到樣品瓶的底部，然後把樣品轉移到進樣瓶或板中繼續進行分析。這種技術我們在實驗室中對需要沉澱蛋白質樣品中已經使用了很多年，而且極少出現顆粒物質相關的問題。我曾經見過這樣的例子，用0.2μm的濾膜過濾之後的樣品，UHPLC進樣，這種樣品還是有一點渾濁並且引起了柱子堵塞，但是這個些微渾濁的樣品離心至澄清之後，柱子堵塞的情況就會減少很多。
使用在線過濾器
我非常認同一個在線的過濾器是LC或者UHPLC中使用成本最低的附加裝置，可以提供最大的投資回報。這種過濾器是一個非常簡單的改裝管配件，其中包含了一個特定孔徑的篩板，安裝在自動進樣器和柱子（保護柱，如果用到的話）之間。現在最普遍的裝置是一個直徑接近37.5px，長度62.5px不鏽鋼配件，其中包含一個0.5或者0.2μm孔徑的可替換的篩板。另外一種裝置是包含相同孔徑大小篩板的PEEK手緊配件。這種PEEK過濾器整體是一次性的，但是因為它比不鏽鋼過濾器中的一次性使用的篩板要貴，使用成本會比較昂貴。這種在線過濾器孔徑會選擇比柱子篩板孔徑小一點，因此它會在柱子堵塞之前先被堵塞。當系統壓力開始增加的時候，你就知道在線過濾器中篩板已經開始堵了，需要在完全堵住之前替換掉。
在線過濾器可以起到單獨的樣品過濾器一樣的功能，但在樣品前處理時，不需要額外的人力工作。如果你樣品離心了，偶爾有一些顆粒沒有過濾掉，也會被下遊的在線過濾器攔截住。在線過濾器的另一優點是它能夠很便捷的更換—如果你動手能力強，在5min內你可以關掉泵、替換篩板、打開系統並繼續實驗。你可能想要重新進一針系統適應性樣品來檢查一下系統有沒有出問題，使用在線過濾器不需要大量的調節和校準，而這些更換保護柱時都需要重新做過。在線過濾器的最後一個好處是可以過濾掉泵密封件和進樣閥因磨損產生的顆粒物。我強烈建議在每一個LC系統中都安裝一個在線過濾器，即使你已經在使用保護柱了。
保護柱
保護柱（也叫做預柱）是一種很短的裝在分析柱上遊的色譜柱。這種柱子一般是10-20mm長，包含與分析柱一樣的填料，使用不大於分析柱篩板孔徑的入口篩板和出口篩板。保護柱有雙重功能，第一，入口篩板攔截可能堵塞分析柱的顆粒物，第二，填料與分析柱相同，它可以捕抓住那些可能會強烈或者不可逆附著在分析柱填料上的物質。因此，保護柱會延長分析柱的壽命。
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