HPLC使用中的七個常見錯誤

    由於沒有考慮到使用一些可以替代的辦法，目前還有七種傳統做法仍然存在於HPLC的技術應用中，而這些做法其實非常不利於HPLC技術的效率提高、運行成本的降低以及運行時間的縮短。本文中將提出一些可行的傳統做法的替代方法，有些人可能會對這些替代方法出現爭議，但如果應用得當的話，這些替代方法勢必會產生顯著的效果。因為相比不停地機械勞作，分析科學家應該更聰明地工作。

　　

　　常見錯誤之一——色譜柱用粒徑5µm的顆粒填充

　　回想一下，多年來標準HPLC分析柱(250mm×4.6mm)都是採用5µm 粒徑顆粒填裝的，然而，事實上3µm 粒徑顆粒填裝的色譜柱(150mm×4.6mm)具有更好的分離效果及更短的分析時間。同時，現在許多實驗室標配的色譜儀是超高壓液相色譜(UHPLC)和液相色譜-質譜(LC-MS)，所以色譜柱更應該換成3µm 或sub-2µm 填裝的色譜柱。

　　值得注意的是：3µm 粒徑顆粒填裝的色譜柱進口孔隙更小，更容易被「髒」的樣品堵塞。

　　常見錯誤之二——使用4.6mm內徑色譜柱(1mL/min)

　　自20世紀70年代初，HPLC分析柱的「標準」內徑就已經是4.6mm了，而近年來，在努力減少溶劑消耗、節約樣品的目標下，許多實驗室已經開始將3.0mm內徑的色譜柱作為更好的選擇，來代替使用4.6mm內徑色譜柱了。如果使用現代的中間分散HPLC儀的話，柱率和柱外頻帶展寬的效果通常不會受到任何負面影響。總之，使用較小內徑的色譜柱是有利的，在梯度洗脫條件下可以獲得更高的解析度。

　　常見錯誤之三——對HPLC的流動相進行過濾

　　通常經淨化系統所得的HPLC級溶劑和水已經足夠乾淨了，如果我們再給它一次額外的過濾，那只會適得其反，引入不必要的化學汙染。事實上，許多實驗室都有自己的一套色譜儀器保養維修計劃，每年對HPLC系統中的過濾器進行更換，所以我們沒有必要再對流動相進一步過濾。

　　例外的是：如果你使用的是離子對試劑、低純度緩衝劑或高鹽含量的流動相時，仍然強烈建議你對流動相進行過濾。

　　還有一種情況是有必要進行額外過濾的，即如果由於水源的質量不好或者其他原因導致從淨化系統流出的水不夠乾淨的時候。

　　常見錯誤之四——使用緩衝劑流動相

　　當分析酸性或者鹼性分析物的時候，有必要對流動相進行酸化或者鹼化。簡單的流動相如含0.1%(體積比)甲酸的水溶液，僅需要將1mL甲酸定容到1升水中即可迅速製備。同樣，含0.1%(體積比)氨的水溶液可以用於多種高pH值兼容柱。當使用低矽羥基活性柱時，無論用低還是高pH值流動相運行，緩衝劑其實都很少用到，包括以流動相A為稀釋劑配製進樣樣品溶液時。

　　例外的是：當分析複雜分子、複雜混合物時，可能仍然需要用緩衝劑流動相，以保持高的選擇性和特別適中的pH值的流動相。

　　常見錯誤之五——每次試驗都重新配製新的參考標準溶液

　　在藥品的質量控制實驗室中，往往每個試驗都會重新配製新的參考標準溶液，實際上這是沒有必要的。許多藥物在低溫和適當的貯存條件下溶液具有足夠的穩定性。所以你可以一次性配製幾百個合格的參考標準溶液置於HPLC小瓶中，然後冷藏或冷凍貯存供以後分析用。而對於試驗結果的長期穩定性研究來說，更應該採用由同一個原始溶液配製而成的標準溶液。當然，對於通常的試驗，標準溶液的儲存條件下的穩定性(保質期)是應該經過驗證的，並記錄首次配製時間。這裡值得我們注意的是：所有的操作都需要做好記錄。

　　常見錯誤之六——對樣品瓶進行搖動

　　搖動(或反轉)樣品瓶會在樣品瓶蓋下面形成一層液體膜，這會對HPLC自動進樣器造成幹擾以至於給出一個混亂的試驗結果。所以即使在排除了故障的情況下，也要始終警惕這一點。

　　例外的是：如果樣品是冷凍過的，那麼解凍後，需要進行渦旋或搖動以確保樣品均勻。

　　常見錯誤之七——使用不鏽鋼卡套作為柱的接頭

　　HPLC系統通常安裝有不鏽鋼接頭和套圈，大多數情況下它們工作得都很好，但是它們不適合用於需要頻繁更換色譜柱時的連接。

　　首先，不鏽鋼卡套只能與為其量身定製的端部管接頭相匹配，而對於不同的色譜柱來說這種「量身定製」只會適得其反。

　　其次，預製的不鏽鋼接頭只能夠重複密封5-10次。當某些製造商的不鏽鋼接頭用於其他品牌的色譜柱時，由於不同端部接頭和插入深度的關係，這個問題會變得尤其明顯。

　　一個可能的解決方案是使用可以用手指擰緊的聚醚醚酮(PEEK)管件，它們價格低廉，並且在5000psi(34.47MPa)壓力下的密封效果也很好。許多較新的UHPLC接頭，其額定壓力為20,000psi(137.9MPa)，只需用手指擰緊，然後用扳手再轉四分之一圈就可以了。

　　譯自：chromatographyonline