北極星環境修復網訊:摘要：採用菌糠協同高效石油烴降解菌 Microbacterium.sp.Q2 進行石油汙染土壤修複試驗研究，分別設置菌糠固定化微生物組(SIM)、菌糠-游離菌組 (SMSB)、菌糠單獨組(SMS)和對照組(CK)4 組修復實驗。考察不同處理方式下對石油汙染土壤微生物數量、酶活性和石油烴降解效果的差異性並確定 石油汙染土壤的最佳修複方案。結果表明:不同修複方式下,SIM 組的土壤呼吸強度、微生物數量及酶活性較其他組有明顯提高,其對石油烴去除率分別 比其他 3 組提高 11.84%、22.15%、54.09%。土壤中脫氫酶活性以及微生物活性與石油烴降解率的相關性顯著，此外菌糠固定化微生物對石油汙染土壤修復具有生物強化和生物刺激協同的作用機制。
關鍵詞：菌糠；固定化微生物；土壤修復；石油烴降解
近年來,石油行業得到了蓬勃的發展,在對石油 的勘探、開發、儲運與加工及使用過程中,原油和原 油製品跑、冒、滴、漏等造成採油區和煉廠附近大 面積土壤汙染[1]。固定化微生物技術克服了傳統方法修復過程中的缺點[2],不僅可以提高菌密度，還有利於屏蔽環境的毒害作用,增強外源菌競爭優勢,提 高降解效率,在石油汙染土壤治理領域中應用越來 越廣泛[3 4]。
菌糠是收穫食用菌後廢棄的培養基質,據統計 每出產 1kg 食用菌約產生 5kg 菌糠,每年約有 8000 多萬 t 廢棄菌糠通過焚燒、填埋等方式處理,不僅佔用了大量土地,燃燒過程中還會產生甲烷等溫室氣 體或有毒化合物(如二噁英)等。研究發現菌糠中富含 有機質、鉀、鈣、鎂、氮、磷以及銅、鋅、鐵等多 種營養元素，加工處理後可用於作物肥料和土壤調理劑[5]，同時其結構疏鬆多孔，表面較粗糙，含有較多官能團和真菌菌絲體，能夠分泌漆酶、錳過氧化物酶 等,可以吸附染料、重金屬、石油烴等多種汙染物質[6],改善土壤肥力。
目前，對於農業廢棄物的資源化利用，將其作為載體材料固定化微生物，在修復有機汙染物方面取得了一定成效[7 8]，但由於其只具備單一的吸附性能， 降解有機物能力相對較弱。而菌糠不僅可以作為微生物載體，又可以通過細菌-真菌-酶體系強化降解有機汙染物[9 10]，發揮雙向優勢，提高汙染物去除效率，因此探究菌糠的綜合資源化利用方式處理環境汙染問題值得探討。
將菌糠與高效石油烴降解菌結合，通過花盆實驗模擬菌糠固定化微生物、菌糠-游離菌以及菌糠單獨添加對石油汙染土壤原位修復，探究修復過程 中對土壤呼吸強度、微生物數量、微生物區系以及 土壤生態毒性的影響差異，確定最優修複方式，為菌糠修復石油汙染土壤的應用提供一定的技術支撐 和理論依據。
1.實驗部分
1.1 實驗材料
實驗土樣取自勝利油田 0~20cm 附近石油汙染土壤,將土樣壓碎翻動至鬆散，風乾後過篩，取 40~80 目之間的土壤，即去除較大雜質和直徑過小的細土， 篩分後的土壤於-20℃低溫冷凍保存。
新鮮菌糠選自山東青島天農食用菌有限公司， 初始溼重 15%，過 40 目篩於-20℃低溫冷凍保存。
1.2 實驗菌株
實驗菌株 Q2 是以勝利油田汙染土壤為菌源，勝利原油為唯一碳源篩選馴化所得土著菌，經 16S rDNA 生物分子學鑑定為 Microbacterium sp.Q2，在原油質量濃度為 1000mg/L 的無機鹽培養基中，微杆 菌 Q2 在 7d 內對石油烴降解率為 45.52%。
1.3 修復實驗設計
採用盆栽(pot experiment)模擬實驗進行石油汙 染土壤修復研究。用磷酸二氫鉀和硝酸鈉調節土壤 C、N、P 的質量比為ω(C):ω(N):ω(P)=100:10:1，修復過程中可直接採用減重法調節各個花盆中的含水 率,使之保持在 18%左右[11]。
試驗分 4 組，每組 3 個平行，共 12 盆，每盆分別加 入 500g 質量分數為 4.57%石油汙染土壤，分別加入 菌糠(SMSB)、菌糠-游離菌(SMS)、菌糠固定化微 生物(SIM)，其中一組為空白對照組(CK)，將 3 個處理 組樣品放於 30℃、60% RH(Relative huity,空氣相 對溼度)的恆溫恆溼培養箱中，每天光照 10h，修復過 程中每隔 7d 採樣測定各花盆中石油烴含量，土壤呼 吸強度、微生物數量及土壤酶活性等指標,試驗周期 為 45d。
1.4 土壤呼吸強度及微生物數量的測定
土壤呼吸強度採用鹼液吸收法測定，稱取10g新鮮土壤於 200mL 燒杯中，其中插入含有 5mLNaOH(2mol/L)溶液的小燒杯,置於 30℃下密封 培養 24h，將溶液轉移至容量瓶中定容，分別以酚酞 和甲基橙為指示劑，用 0.1mol/L HCl 溶液滴定，根據 消耗量計算出土壤呼吸產生 CO2 [mg/(kg⋅h)]的量。
採用稀釋平板計數法測定微生物數量， 稱取 5g 土壤於盛有 100mL 無菌蒸餾水的錐形瓶中，充分振 蕩後進行逐級稀釋於培養基中塗布，牛肉膏蛋白腖固體培養基用於計數細菌數量，孟加拉紅培養基用 於計數真菌數量。將塗布好的培養基置於 30±2.0℃ 恆溫培養箱中培養 5d 後計數。
採用 DNA 提取-PCR 擴增-DGGE 電泳的分子 生物學方法，在修復的第 7d、第 21d 和第 45d，分別 採集 4 組盆栽中的土樣,提取其總 DNA，對 16SrDNA 的V3可變區進行PCR擴增，擴增產物由變形梯度凝 膠電泳(DGGE)進行檢測，研究土壤的微生物區系動 態變化。
1.5 土壤生理生化參數及生態毒性測定
土壤中漆酶活性測定採用 ABTS-紫外分光光 度法，以檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液(pH=4.5)，於 420nm 波長下測定吸光度;錳過氧化物酶活性採用 愈創木酚-紫外分光光度法，以磷酸為緩衝液(pH= 7.0)，於 470nm 波長下測定吸光度，定義吸光度每分 鍾變化 0.01 為一個酶活單位(U)。
儲存在活細胞中的螢光素二乙酸酯(FDA)能夠 被細菌以及酯酶等非專一性酶類水解，釋放出螢光素，因此 FDA 水解酶能夠較好反映土壤微生物活性 以及土壤質量的變化[12]。脫氫酶是微生物呼吸過程 中分泌的胞內酶[13]，它們與微生物種群密切相關，對 環境擾動非常敏感.因此,考察這兩個指標不僅可以 表徵土壤的生態毒性,還能從側面反應汙染物的降 解效果。
其中 FDA 水解酶以螢光素二乙酸酯為底物，採 用分光光度法於 490nm 處測定吸光度;脫氫酶活性 採用三苯基四氮唑氯化物(TTC)還原法於 485nm 處 測定吸光度數值來表示酶活性大小。
1.6 土壤石油烴含量的測定
土壤中石油烴含量採用超聲-索氏萃取-重量 法測定。具體步驟為準確稱取 5.00g 土樣於離心管中， 以二氯甲烷為萃取劑,振蕩,超聲萃取 15min，重複 3 次，萃取結束後離心分離，將上清液倒入燒瓶，於 54℃ 旋轉蒸發至幹且恆重，燒瓶前後質量差即為石油烴含量。
1.7 土壤石油烴降解動力學方程
一級動力學方程，土壤剩餘石油烴含量時間變 化動力學模型回歸方程為:
v> 式中：C0 為初始石油烴含量；C 為時間 t 下石油烴含 量； t 為修復時間；k 為微生物降解速率常數。
1.8 數據統計分析
實驗所得數據採用Excel 2010和origin 9.0進行處理和製圖，採用 SPSS 22.0 軟體進行主成分分析。
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