Nature | 破解Wnt信號高效遠距離傳遞之謎

形態發生（Morphogenesis）是指生物體在遺傳信息和環境因素的影響下，通過細胞分化、組織與器官發生、發育等過程而逐漸成形（shaping）的過程。形態發生素（morphogen）作為介導機體形態發生的蛋白質，通過在組織中擴散並形成連續的濃度梯度，參與了機體組織修復和發育中的細胞命運決定，研究較多的形態發生素包括BMP、Catenin、Dpp、FGF、SHH、TGF-β 和Wnt等【1】。

Wnt信號通路是一種進化上高度保守的信號通路，在生物體的生長發育和代謝調節中發揮了關鍵作用【2】。Wnt信號傳導需要位於胞外的Wnt 蛋白通過擴散與細胞膜上的受體結合，繼而激活下遊的胞內信號轉導及核內轉錄調控。Wnt在發育中具有形態發生素功能，而糖基化修飾和棕櫚醯化修飾導致Wnt 蛋白具有高度不溶性，近年來研究推測脂蛋白顆粒、外泌體或特定的分子伴侶可能在其中發揮了重要作用，以協助克服Wnt信號傳遞過程中的溶解度和擴散性問題【5, 6, 7】。儘管如此，疏水性脂蛋白Wnt是如何在胞外水溶性空間中擴散到較遠的作用部位的，目前仍未完全清楚【3, 4】。

近日，英國弗朗西斯·克裡克研究所Jean-Paul Vincent教授與牛津大學E. Yvonne Jones教授團隊合作在Nature雜誌發表了題為Glypicans shield the Wnt lipid moiety to enable signalling at a distance的研究文章，發現磷脂醯肌醇蛋白聚糖Dlp的蛋白核心能通過構象變化形成疏水空間，進而結合併遮蔽Wnt蛋白的脂質部分，提高了Wnt的水溶性並促進了Wnt信號的傳遞。

Wnt與果蠅的無翅基因Wingless（wg）同源，果蠅翅成蟲盤中的Wg信號易被檢測且擴散範圍較遠，能夠實現Wg對遠距離靶基因的調節，因此果蠅翅成蟲盤是研究Wnt信號擴散與遠距離調節機制的良好模型。之前觀點認為脂蛋白微粒或外泌體能夠在胞外轉運Wnt蛋白，作者利用基於形態捕捉技術（morphotrap，捕捉並困住形態發生素並抑制其功能）的捕捉分析手段及遺傳學檢測證明胞外Wg的轉運並不依賴於外泌體、脂蛋白或微膠粒。另一種假說認為載脂蛋白Swim能夠溶解並介導Wg的胞外轉運【7】，作者發現Swim的敲除並不會顯著影響果蠅翅成蟲盤中胞外Wg蛋白的分布，因此Swim在Wg的胞外轉運中並不是必需的。除了目前因技術限制無法驗證胞體素（cytonemes）在Wg轉運中的功能外，作者證明之前推測的協助胞外Wg轉運的外泌體和脂蛋白模型均不成立。

圖1 胞外Wg蛋白的擴散依賴於磷脂醯肌醇蛋白聚糖Dlp

之前已有研究發現磷脂醯肌醇蛋白聚糖Dally和Dlp能夠調節Wg在細胞外的分布，且最新研究發現果蠅卵巢中的Dlp能夠起到抑制Hh和Wnt信號的作用（詳見BioArt報導：Sci Adv | 解亭團隊揭示磷脂醯肌醇蛋白聚糖Dlp介導的Hh/Wnt信號相互依存調控幹細胞分化的機制）。通過克隆分析，作者發現Dally和Dlp的缺失會導致細胞表面Wg表達顯著降低，且Dlp缺失所導致的Wg下調表型更加明顯（圖1）。Dlp可以通過兩種方式與Wg的結合，一是通過Dlp的硫酸肝素鏈，二是通過Dlp的蛋白核心【8】。通過檢測Dlp與Wg的結合，作者發現Dlp能夠結合棕櫚醯化的Wg，但突變導致的非棕櫚醯化Wg (S239A) 不能與Dlp結合。進一步研究發現，Dlp蛋白核心介導了Dlp與棕櫚醯化蛋白的結合，而Dally的蛋白核心無法與棕櫚醯化蛋白結合。因此，磷脂醯肌醇蛋白聚糖Dlp，而不是Dally，具有與棕櫚醯化的Wg結合的能力。人類具有6個磷脂醯肌醇蛋白聚糖，作者發現其中的GPC4和GPC6能夠與Wg蛋白結合。此外，GPC4和GPC6與Dlp類似，同樣具有雙相活性（biphasic activity），既能夠抑制高表達目的基因的表達水平，又能促進低表達目的基因的擴散範圍。因此，人類Dlp家族的磷脂醯肌醇蛋白聚糖可以與Wnt蛋白的棕櫚醯化部分結合，調節了Wnt蛋白的胞外行為。

圖2 Dlp與Wnt蛋白的結合機制 （PMS：棕櫚醯化的絲氨酸）

溶解性對Wnt信號的擴散和傳遞至關重要，Dlp在與Wnt蛋白的棕櫚醯化部分結合後，能通過增加Wnt蛋白的溶解性，促進Wnt信號的擴散。那麼，Dlp是如何與Wnt的棕櫚醯化部分結合的呢？通過比較Dlp蛋白核心與Wnt受體Frizzled結構上的差異，作者發現Dlp的N末端區域與Frizzled家族的胞外半胱氨酸富集結構域（CRD，cysteine-rich domain）有一定的相似性。Frizzled的CRD結構域能通過形成 「槽形結構」（groove-like structure）結合併包裹Wnt的棕櫚醯化位點，而Dlp 和GPC1同樣含有一個較淺的槽形結構，並額外含有一個橫向位於溝槽入口的α-螺旋，從而阻礙了脂質插入（圖2a）。通過解析Dlp蛋白核心與棕櫚醯化WNT7A結合後的複合體結構，作者發現Dlp和Wnt之間主要通過疏水作用發生互作，Dlp與Wnt棕櫚醯化部分的結合導致複合體構象發生變化（圖2b）。因此，複合體的晶體結構解析數據同樣證明了Dlp-Wnt的相互作用需要脂質部分（lipid moiety）的參與（圖2c）。位點突變分析表明，Dlp和Dally與Wnt結合能力不同是由一系列結構差異共同導致的，如槽形結構入口和腔內殘基的性質差異，以及α-螺旋-9和α-螺旋-10相對於α-螺旋-1發生移位的結構特徵不同等。

綜上所述，本研究通過遺傳學分析並結合蛋白結構解析，證明磷脂醯肌醇蛋白聚糖Dlp的蛋白核心能通過構象變化形成槽形結構，進而結合併遮蔽Wnt蛋白的棕櫚醯化部分，提高Wnt蛋白的水溶性，使胞外的Wnt能夠擴散並與受體結合，實現Wnt信號通路的高效傳遞。

原文連結：

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2498-z

製版人：十一

參考文獻

1. Gurdon J B, Bourillot P Y. Morphogen gradient interpretation. Nature, 2001, 413(6858): 797-803.

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3. Willert K, Brown J D, Danenberg E, et al. Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors. Nature, 2003, 423(6938): 448-452.

4. Takada R, Satomi Y, Kurata T, et al. Monounsaturated fatty acid modification of Wnt protein: its role in Wnt secretion. Developmental cell, 2006, 11(6): 791-801.

5. Panáková D, Sprong H, Marois E, et al. Lipoprotein particles are required for Hedgehog and Wingless signalling. Nature, 2005, 435(7038): 58-65.

6. Gross J C, Chaudhary V, Bartscherer K, et al. Active Wnt proteins are secreted on exosomes. Nature cell biology, 2012, 14(10): 1036-1045.

7. Mulligan K A, Fuerer C, Ching W, et al. Secreted Wingless-interacting molecule (Swim) promotes long-range signaling by maintaining Wingless solubility. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109(2): 370-377.

8. Yan D, Wu Y, Feng Y, et al. The core protein of glypican Dally-like determines its biphasic activity in wingless morphogen signaling. Developmental cell, 2009, 17(4): 470-481.