撰文 | Renée van Amerongen
編譯 | 酶美
責編丨迦漵
2020年度加拿大Gairdner基金會將生物醫學獎授予了Roel Nusse教授，他在Wnt signaling領域的奠基性工作幫助學界在發育生物學、癌症和幹細胞研究獲得了深入理解和長足發展。Wnt這個名字來源於果蠅基因突變表型Wingless和乳腺癌MMTV反轉錄病毒插入int-1基因位點。毫不諱言，Nusse教授系列工作為整個領域插上了翱翔的翅膀。近日，Cell 雜誌Leading Edge專欄由來自Nusse教授有深厚淵源的荷蘭阿姆斯特丹大學的Amerongen教授系統介紹了Nusse教授發現Wnt的系列歷程。
Roel Nusse（1950—），史丹福大學教授、HHMI研究員、美國國家科學院院士、細胞信號轉導與幹細胞領域的先驅者，1982年發現Wnt基因，HHMI研究員。
多細胞生物面臨非常繁重的任務，將細胞拼裝組織成繁複各異的組織。它們不僅需要在胚胎發育階段發展功能形態多樣的組織，在成體階段還需要有效地維持組織穩態平衡。組織器官處於動態更新循環中；而細胞增殖和分化的失衡會造成機體眾多疾病：不受控制的細胞增殖是腫瘤形成的基礎；組織系統失調常常是神經退休性疾病和衰老的特徵。
在過去40年中，Wnt信號傳導通路作為細胞間交流重要的手段，在眾多生物學過程有重要作用。它在多細胞生物中廣泛保守，是胚胎發育模式形成必不可少的調控機制。Wnt不僅影響發育生物學和進化生物學；在生物醫學領域也有深遠影響。而Roel Nusse教授在Wnt眾多領域都有重要貢獻，引領了它的發展。
01克隆int-1基因
Nusse與Wnt的偶然結緣在1970年代，當時他還是荷蘭癌症研究中心的一名研究生。他在研究一種乳腺癌腫瘤病毒MMTV，這是一種反轉錄病毒，科學家很早就知道它能引起不同品系老鼠的乳腺癌，但機制未知。而荷蘭癌症研究中心早在1930年代開始就圍繞MMTV開展眾多研究，Nusse的課題是其中之一。
1970年代，重組DNA技術開始嶄露頭角。DNA克隆可以將來自不同物種的DNA分子粘合拼接在一起。科學家意識到這種技術有一定危險性，在著名的Asilomar會議上還討論了實驗指導條例。彼時，多數科學家尚未能接觸DNA分子；更遑論對DNA進行實際操作。同時，關於什麼造成了腫瘤癌症發生也是一個熱烈討論的問題。當時頂尖研究已知道快速轉化Rous肉瘤病毒攜帶有致癌基因，是後來被發現的v-src基因。而其它的慢轉化病毒，比如MMTV則沒有發現具體致癌基因。其後，Harold Varmus和J. Michael Bishop的諾獎工作（1989年的諾貝爾生理學或醫學獎）揭示了v-src基因在細胞中有同源位點：c-src，病毒對原癌基因的調控是腫瘤發生的關鍵。原癌基因c-src在多個物種中被發現，這提示癌症起源於正常細胞變異，那麼MMTV是否是通過激活這些原癌基因來誘發腫瘤呢？
Roel Nusse一開始集中研究精力在MMTV感染機制和它的一些蛋白的性質上。1980年開始，研究者有機會接觸到重組DNA技術，以期能揭開MMTV整合進乳腺上皮細胞帶來的改變。當時，Nusse和Harold Varmus開始聯繫，後者亦同樣對MMTV致癌之謎非常感興趣。Nusse來到Varmus在加州大學舊金山分校的實驗室進行博士後研究。在正式接受信件中描繪了一系列有趣的課題，其中提及一項今後將成為開創性工作的研究-直接在腫瘤DNA中尋找那些重要「顯性」的原病毒基因。在Nusse的個人陳述中也提到這項工作，而這封正式接受信被美國醫學圖書館收藏保存。
Nusse和Varmus開始尋找MMTV在腫瘤組織的整合位點。在這個特殊的整合位點(int-1)上，病毒插入了未知基因附近，通過病毒LTR的超強調控元件改變未知基因的表達。同時還有許多其它腫瘤組織也有病毒整合在int-1位點附近，進一步提示int-1位點變異可造成乳腺腫瘤。一年後，int-1位點基因被克隆。int-1基因序列與已知任何致癌基因沒有同源性，這是一個全新的致癌基因【1】，相關工作於1982年發表在Cell雜誌上。
完成博士後研究後，Nusse回到荷蘭癌症研究院。在這裡他和同事努力想要找到int-1基因的功能和致癌機理，但早期工作收效甚微。儘管重組DNA技術得到廣泛應用，當時並沒有得到很多基因序列，UCSD資料庫中只有約2000個基因序列信息。因此，沒有發現int-1基因與任何已知基因同源，只發現其N端為疏水結構域—這是Wnt蛋白的分泌信號。製備int-1基因蛋白抗體的工作也並不順利。int-1基因轉錄本可見在胚胎發育階段表達，而沒有發現其在成體階段表達。通過和Anton Berns合作，他們還開發了int-1轉基因小鼠。轉基因小鼠不能成活，因此也未能研究成體階段腫瘤生成。
02跨越系統，Wnt在模式生物中研究
因為int-1基因集中在胚胎階段表達，並在物種間高度保守。1986年開始，Nusse試圖克隆int-1在果蠅中的同源基因，以著手研究篩選有發育缺陷的基因突變。幸運的是，他們成功地定位了基因位點，正是體節極性基因wingless（wg）。int-1基因成為了首個已知的哺乳動物致癌基因在生物正常發育中也有重要作用，可造成果蠅發育缺陷【2】，相關工作於1987年發表在Cell雜誌上。
隨著同源基因克隆，而果蠅遺傳研究工具多樣突變眾多，Nusse得以開啟了全新研究局面。製備wg蛋白抗體的工作也非常順利。早期研究發現，它影響作用於非自主細胞；其序列進一步提示wg是分泌性蛋白。通過和劍橋大學Peter Lawrence合作，他們找到了wg在幼蟲行使功能的具體區域。電鏡研究發現，wg蛋白信號位於胞質和胞外的囊泡中，在產生它和engrailed表達可接受wg信號的細胞中都可找到。Nusse在文章中總結到：wingless蛋白可被旁分泌，影響附近細胞【3】。
1989年，Roel Nusse來到史丹福大學，加入新成立的Beckman分子遺傳醫學中心發育生物學系。團隊還構建了wg轉基因品系，過表達wg同樣產生了胚胎發育表型。這樣，他們可利用此表型篩選抑制子，找到調控wingless的上下遊基因。當時多個研究組採用了類似的篩選策略，充分利用了果蠅強大遺傳學工具。
早在1980年代初期，德國科學家Christiane Nüsslein-Volhard和Eric Wieschaus分離鑑定了果蠅中的系列體節發育基因，這是又一項諾獎工作。wingless屬於其中的體節極性基因類別。Mark Peifer 和 Eric Wieschaus隨後找到另一個作用於wg的基因armadillo（arm）--arm同樣可影響果蠅模式發育和果蠅成體。結合突變克隆和遺傳上位實驗，Nusse, Peifer, Perrimon和Wieschaus實驗室發現了wg通路眾多基因，並決定它們先後作用的順序。至此，他們的工作完整的展示了Wnt信號通路的核心機制。
在領域得到拓寬發展的時候，有遠見的科學家開始討論對int-1/wingless相關蛋白新的命名系統規則。Andrew McMahon和Randall Moon也參與到命名規則制定討論中，他們在老鼠和爪蟾中鑑定了很多int-1相關基因，著名的爪蟾前後軸決定發育實驗揭示了int-1在脊柱動物早期發育階段的功能。「Wnt（wint）」這個名字來指定具有wingless表型有MMTV整合位點的基因家族。Wnt名字來源的另一個傳說是Roel Nusse的妻子Betsy建議。
儘管找到了大部分Wnt通路的基因，仍然有兩個重要的問題還沒有得到回答。細胞表面響應結合Wnt信號的受體還不知道；另一個問題是信號傳遞到Armadillo後，下遊是什麼。果蠅系統研究再次為這兩個問題提供了部分答案。Nusse和Jeremy Nathans合作研究找到frizzled 2是wg的受體之一。而關於Armadillo下遊的問題則被另一位科學家找到了答案，這也是Wnt 領域少數幾個沒有來自Nusse的重要工作。
脊柱動物中beta-catenin（CTNNB1）是果蠅armadillo的同源基因，有粘連蛋白功能。在Nusse克隆fz2的時候，來自Hans Clever和其他幾個歐洲實驗室的工作表明CTNNB1可以和下遊轉錄因子TCF/LEF家族蛋白相互作用。Hans Clever當時研究TCF1這個基因，TCF1是T細胞發育中重要的轉錄因子。Walter Birchmeier研究則集中在E-cadherin，發現它可以和CTNNB1結合，抑制腫瘤浸潤和轉移。酵母雙雜交實驗證實了CTNNB1可以和TCF1、LEF1結合。
這些實驗結果說明了Wnt信號通路可以調節下遊目的基因的轉錄；同時酵母雙雜實驗被演變發展成了檢測Wnt信號通路活性的重要實驗—著名的TOPFLASH實驗：Luciferase基因上遊被插入數個串聯的TCF/LEF結合位點，通過測量Luciferase螢光強度來反映Wnt信號通路的激活狀態。
Paul Polakis和其他人還發現CTNNB1可以和著名的抑癌蛋白APC相互作用，進一步提示Wnt信號通路和癌症之間有不可分割的聯繫。在1998年，科學家整合遺傳生化實驗的證據建立了Wnt信號通路的工作原理（經典Wnt信號通路）：在未有Wnt信號時，通過降解複合物來降解CTNNB1蛋白；而Wnt信號胞內傳遞則抑制了降解複合物的活性，CTNNB1蛋白可入核和TCF1/LEF1蛋白結合，激活下遊基因的轉錄。
03Nusse，Wnt signaling來到幹細胞研究
與此同時，Nusse轉而重新著手解決Wnt蛋白的純化問題。早在1988年，他們就試圖表達純化活性Wnt1蛋白，但沒有成功。在2003年，Karl Willert和Roel Nusse成功地得到了活性小鼠WNT3A蛋白。成功的訣竅是細胞培養基中加入血清蛋白，並利用去垢劑在分離純化步驟中保持Wnt蛋白的可溶性。沒有去垢劑，Wnt蛋白則會因為翻譯後的脂化修飾變得疏水難溶，失去活性【4】。
這一重要的工作成果開啟了Nusse研究新的一頁，他逐漸從果蠅系統轉移到哺乳動物組織的研究。Wnt/CTNNB1信號通路不僅對生物機體發育非常重要，他們也逐步發現Wnt可參與維持組織穩態平衡，這意味著它可能調控幹細胞。2010年，Nusse實驗室工作展示了WNT3A蛋白可調節包括胚胎幹細胞在內的多種幹細胞自我更新。
Nusse的研究工作回到了最初開始的地方，研究乳腺上皮幹細胞。Roel Nusse最近的工作是利用在細胞示蹤技術，在多個組織中包括肝和血管內皮找到了Wnt調控的幹細胞組群【5】，相關工作發表在Cell Stem Cell雜誌上，第一作者曾藝博士現為中科院上海生化細胞所研究員（Cell突破！曾藝組首次鑑定小鼠胰島成體幹細胞，建立胰島類器官體外長期擴增培養體系）。
04總結展望
Roel Nusse當之無愧地獲得本年度Gairdner獎，他的工作帶來了很多重大突破，橫跨癌症和幹細胞等多個領域。在Nusse和Varmus最初的MMTV篩選之後，利用反轉錄病毒插入進行突變篩選，數十年來找到了很多致癌基因。多個模式生物的研究揭示了Wnt在組織再生中有重要的調控作用。被評為2017年度技術的類器官培養就應用了幹細胞基礎研究成果，給再生醫學帶來了很多希望。成體幹細胞的長期培養無一例外地需要Wnt/CTNNB1加入。
因為Wnt信號通路擁有很多重要功能，多種靶向Wnt通路的藥物在開發之中。Wnt抑制劑以阻斷腫瘤中的異常信號傳遞；而Wnt激活劑可調動幹細胞以幫助組織再生和損傷修復。正常Wnt1基因的高表達可造成乳腺腫瘤則改變了我們的認識，不僅僅是基因突變，而改變基因的mRNA和蛋白水平也可造成癌症。科學家意識到正常的發育調節通路可被腫瘤細胞劫持來維持它的生長分化。阻斷Wnt信號分泌的抑制劑，以及幹擾WNT/FZD結合的抗體的開發都很成功。臨床應用的難點主要在於治療的同時能保證Wnt正常生理功能。
WNT/CTNNB1隻是Wnt信號通路的一部分，另一部分Wnt信號通路不依賴於CTNNB1傳遞--非經典Wnt信號通路。非經典Wnt通路調控了包括Planar Cell Polarity，Convergent extension等多個複雜的細胞系統遷移，並可影響癌細胞發生發展。新一代科學家將在這一領域繼續探索研究。
Roel Nusse更願意介紹他的研究是幹細胞而非局限於Wnt。但是毫無疑問，Nusse是整個Wnt研究領域的傳奇。他也是一個大家長：每個Wnt相關重要會議都由Nusse來結束，他拿著話筒感謝會議組織者，總結會議亮點，指出關鍵問題。20年來，Nusse還堅持不懈地更新維持Wnt主頁（(http://wnt.stanford.edu)。每一個新進入Wnt的研究者都收益於此。網站匯聚了很多實驗室的未能發表的負結果，還有實驗竅門比如純化的Wnt蛋白可能的陷阱。
自1990年開始，Nusse一直是HHMI的研究員，接受其資助。2020年，Nusse將慶祝他70周歲的生日，他仍然致力於探究組織發育和維持的基礎原理。希望他的70世代將開啟更多更美好的探索。
值得一提的是，Nusse還曾獲得300萬美金的「生命科學突破獎」。
參考文獻
1. Nusse, R., and Varmus, H.E. (1982). Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome.Cell31, 99–109.
2. Rijsewijk, F., Schuermann, M., Wagenaar, E., Parren, P., Weigel, D., and Nusse, R. (1987). The Drosophila homolog of the mousemammary oncogene int-1 is identical to the segment polarity gene wingless.Cell50, 649–657.
3. van den Heuvel, M., Nusse, R., Johnston, P., and Lawrence, P.A. (1989). Distribution of the wingless gene product in Drosophila embryos: a protein involved in cell-cell communication.Cell59, 739–749.
4. Willert, K., Brown, J.D., Danenberg, E., Duncan, A.W., Weissman, I.L., Reya, T., Yates, J.R., 3rd, and Nusse, R. (2003). Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors.Nature423, 448–452.
5. Zeng, Y.A., and Nusse, R. (2010). Wnt proteins are self-renewal factors for mammary stem cells and promote their long-term expansion in culture.Cell Stem Cell6, 568–577.