生科鄧宏魁課題組與合作者在Science報導功能成熟細胞在體外長期...

2019年4月26日，北京大學生命科學學院鄧宏魁教授課題組、解放軍總醫院盧實春教授課題組和復旦大學袁正宏教授課題組合作,在《科學》（Science）雜誌上發表了題為「原代人肝臟細胞在體外的長期功能性維持（Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro）」的研究論文，首次證明利用化學小分子調控細胞信號通路，實現了功能細胞在體外的長期維持，這為大量製備功能成熟細胞及其應用提供了可能。

如何誘導獲得功能成熟的細胞並在體外保持其功能性是再生醫學的關鍵瓶頸。研究團隊致力於在體外獲得大量功能性細胞。在個體發育過程中，多種發育信號精確調控，分化產生功能各異的細胞並長期穩定地維持其生理功能。然而，這些功能細胞一旦離開體內微環境便會迅速去分化並失去功能。此外,由於缺乏適當的培養條件與微環境，體外源於幹細胞誘導分化所獲得的功能細胞，很難真正成熟並長期維持其功能，是再生醫學研究和應用中長期面臨的挑戰。過去幾十年裡，人們嘗試了改變培養材料、共培養及三維培養等多種方法，但始終未能建立一個簡單高效且穩定的功能細胞體外培養體系。為解決這一問題，鄧宏魁課題組組以體外培養過程中快速失去功能的人原代肝細胞為研究對象，篩選到五種化學小分子組合（5 compounds，5C）並利用它們在體外成功實現了肝細胞功能的長期維持。在超過一個月的培養過程中，5C組合抑制了肝細胞的去分化，細胞整體基因表達譜與體內肝細胞高度相似，並長期維持了白蛋白分泌、尿素合成、藥物代謝等肝細胞功能。

人原代肝細胞在五個化學小分子的協同作用下，能夠在體外長期維持功能。這些長期維持功能的人肝細胞在藥物研發方面具有廣泛的應用價值；另一方面，它們可以支持B肝病毒（HBV）完整的病毒複製周期，包括持續的產生共價閉合環狀DNA（cccDNA），這為抗B肝病毒藥物提供了理想的高通量篩選模型

肝細胞在體外藥物代謝及藥物研發方面具有重要的實用價值，然而長期以來功能維持條件的缺失極大限制了肝細胞的應用。在鄧宏魁課題組新建立的5C培養體系中，體外培養的肝細胞能合成與體內水平相似的藥物代謝酶，並具有長期維持藥物代謝的能力，極大拓展了其在藥物代謝、藥物相互作用和藥物毒性等方面的應用。與此同時，研究團隊基於5C培養條件，成功建立了B型肝炎病毒感染模型：持續高水平表達B肝表面抗原、e抗原、合成B肝病毒DNA等感染指標，尤其是能夠長期穩定產生B肝病毒複製必需的cccDNA。這一模型的建立，對於B肝病毒的深入研究與藥物研發具有重要意義。我國約有1.2億人攜帶B肝病毒，目前仍無有效的治癒方法。因為B肝病毒侵入肝細胞後,形成了一種很難被清除的病毒複製模板cccDNA，目前還沒有針對這個病毒複製關鍵靶點的藥物。相形之下，C型肝炎病毒的發現雖然晚於B肝病毒，但基於有效的體外病毒感染模型已成功篩選並獲得治癒C肝的藥物。5C培養條件下的肝細胞支持B肝病毒的高效感染，並能夠長期產生cccDNA，可作為理想的藥物篩選模型，為治癒B型肝炎帶來希望。

相比於傳統遺傳學方法，化學小分子能夠實現對多個信號通路靶點的精細調控。過去幾年，鄧宏魁課題組在化學小分子調控細胞命運方面取得一系列突破性進展：誘導體細胞重編程為多潛能幹細胞(CiPS細胞）；誘導皮膚成纖維細胞為功能神經元細胞(CiN）；建立了具備全能性功能特徵的多潛能幹細胞(EPS細胞)。他們利用化學小分子實現了體外肝細胞功能的長期維持。這項工作表明化學小分子在精細調控細胞命運和功能上的優越性，這一方法也為其它類型細胞體外功能的長期維持提供了新途徑。

鄧宏魁、盧實春和袁正宏為該論文的共同通訊作者，向晨罡博士、杜媛媛博士與孟高帆博士為該論文的共同第一作者。該工作獲得北大-清華生命科學聯合中心、國家重點研發計劃、國家自然科學基金等支持。

專家點評

聞玉梅（中國工程院院士、復旦大學上海醫學院教授，病毒學家，長期從事B型肝炎病毒持續性感染機理及對策相關研究）

由鄧宏魁、盧實春、袁正宏作為共同通訊作者發表於《科學》（Science）雜誌的論文:「體外長期維持原代肝細胞功能」,是我國學者研究B肝、C肝以及其它肝臟疾病機理的一項重大突破。作者們通過用FSK、SB431542、DAPT、IWP2及LDN193189等五種化合物，成功實現了在體外將人肝細胞延長培養至四周。用此技術體外培養的肝細胞，不僅保持了肝細胞的生理功能，最有意義的是，這些在體外維持數周的肝細胞可成功地被B肝病毒感染，表達HBsAg與HBeAg。通過對比，發現B肝病毒與C肝病毒感染過程有較大不同。這一研究最重要的價值是細胞被B肝病毒感染後，可以完成整個病毒複製周期，包括產生共價閉合環狀DNA（cccDNA）；而cccDNA正是目前B肝病毒難以被清除、疾病難以被治癒的關鍵。通過這一平臺，人們將可更深入提出解決cccDNA的策略。作者們還在這一平臺上對現有臨床實用的抗B肝病毒核苷類藥物與幹擾素進行考核，證實了核苷類藥物可抑制經細胞培養的B肝病毒，經幹擾素處理後細胞可上調幹擾素激活的基因控制B肝病毒。用此建立的較長期的人肝細胞體外培養平臺，不僅將為研究B肝治癒推進一大步，還提供了創新性研發抗肝炎病毒藥物的重要工具。

孫序序（上海交通大學基礎醫學院研究員，長期從事肝臟疾病相關研究）

肝臟是體內重要器官，負責代謝、解毒、造血凝血、免疫等功能。肝細胞是佔肝臟80-90%的肝實質細胞，是肝臟功能的主要承擔者。原代肝細胞分離和體外培養為模擬肝臟疾病和分子機制研究提供了重要方法和材料。但是新鮮分離得到的原代肝細胞體外培養只能維持10-14天，過程中肝細胞功能會快速喪失，隨後變成纖維樣間質細胞，最後發生細胞凋亡。這對於體外操作細胞並精確模擬體內疾病和分子機制研究帶來困難。因此，如何保持肝細胞在體外長期培養過程中性狀穩定並與體內功能一致，是肝臟研究領域長期未解決的問題和難題。

最近一期Science報導北京大學鄧宏魁教授研究組等發現利用五種小分子化合物組合處理實現在體外長期培養肝細胞時穩定保持其功能的新方法。該研究首先從比較新鮮分離的人原代肝細胞與培養24小時後的肝細胞轉錄表達譜入手，發現體外培養24小時後肝細胞基因表達即發生變化，有15個主要的肝功能相關基因被下調達10倍。同時TGF-信號通路被上調，提示原代肝細胞體外培養24小時即觸發啟動上皮-間質轉化程序，推動細胞命運改變，正常肝細胞功能走向喪失。通過隨後加入TGF-小分子抑制劑SB431542可以保持一定的上皮細胞性狀，但仍不能阻止肝功能相關基因表達被下調，提示仍存在其它負向調控肝細胞穩定的信號。研究組繼續通過小分子藥物篩選，最終發現在體外培養液中加入五種化合物組合：FSK、SB43、DAPT、IWP2和LDN193189，可以很好地延長培養時間至四周，在此期間並有效保持肝細胞極性性狀和肝功能相關基因的穩定表達。這五種化合物分別為cAMP激動劑、TGF-抑制劑、Notch抑制劑、Wnt抑制劑和BMP抑制劑，這些信號通路主要涉及肝細胞細胞轉化、增殖等過程，而抑制劑的加入可能模擬體內微環境中所釋放信號的綜合效應，達到維持肝細胞穩態的作用。

這種化合物組合穩定的體外培養原代肝細胞可以用來進一步進行體外肝臟功能及機制研究。作者首先驗證了肝細胞藥物的解毒功能，發現肝細胞解毒特異酶CytochromeP450家族成員都保持了與新鮮肝細胞同等的藥物代謝活性。

除此之外，研究組發現這些延長培養的肝細胞持續穩定表達B肝病毒HBV受體蛋白NTCP，提示其可作為研究HBV感染的體外模型。HBV感染是我國肝炎和肝癌發生的主要原因，但是由於HBV感染具有嚴格的種屬特異性，使得包括小鼠在內的動物模型並不能感染人HBV，這是長期以來人HBV病毒感染基礎研究的障礙。該研究中，作者通過利用HBV感染證明這些穩定培養的肝細胞可以準確模擬體內HBV感染進程。除此之外，西方人群中較常見的C肝病毒HCV感染也可以在這些細胞中有效進行，並且當用抗HCV病毒藥物daclatasvir處理時，肝細胞可以對藥物做出反應。

該項研究首次發現了五種小分子化合物組合應用可以有效延長原代肝細胞體外培養時間並保持其生物學功能穩定，在時間上和功能上均保證了其作為體外模擬病毒感染模型的可行性。這對於探索病毒感染機制具有重要意義，也將為大規模抗病毒藥物篩選提供新方法。未來這項體外延長培養的肝細胞是否可應用於其它肝臟疾病體外模擬、幹預和基因操作等分子研究，值得進一步探索。

原文連結：專家點評Science | 小分子，大作為：鄧宏魁/盧實春/袁正宏合作團隊突破人肝細胞體外長期培養瓶頸