今天小編要和大家分享的是去年12月發表在OncoImmunology（IF:5.869）雜誌上關於免疫聚焦多組學數據分析前列腺癌的文章,更多生信人原創文章見：生信人。
Immune-focused multi-omics analysis of prostate cancer: leukocyte Ig-Like receptors are associated with disease progression
前列腺癌免疫聚焦多組學分析：白細胞 lg樣受體與疾病進展相關
一．研究背景
近年來，免疫檢查點抑制劑的發展使腫瘤免疫治療發生了巨大的變化。免疫檢查點是一系列受體/配體，可以抑制或激活免疫細胞的功能。然而，到目前為止，前列腺癌(PCa)免疫療法對晚期癌症療效仍然是有限的。因此，今天分享的文章整合多組學分析研究了LILR家族基因，特別是LILRB1作為PCa免疫治療靶點的潛力。
二．數據與方法
1.患者及數據集：作者從TCGA下載了498個樣本的NGS RNA-seq，miRNA，甲基化，CNA，SNP數據，及從GDC下載了相關的臨床數據。作者也從GEO下載了106例患者的RNA-Seq及臨床數據。此外，作者也收集了溫哥華前列腺癌中心（VPCC）中85例患者的RNA-Seq及臨床數據作為驗證集。
2.組學數據的處理：
1）RNA-Seq 數據：作者完全分析RNA-Seq數據，以避免數據處理中的變異性。同時使用共同的分析 pipeline確保轉錄組數據集綜合分析的準確性。原始FASTQ文件使用FastQC定量Trimmomatic修飾。
2）miRNA 數據：作者對來自TCGA的level 3 NGS miRNA數據進行標準化，將標準化計數為零或NA的miRNA從miRNA數據集中刪除。
3）甲基化數據：使用level 3的甲基化數據且選擇β值，使用值評估甲基化水平，值表示甲基化和未甲基化等位基因之間的比率強度。
4）CNA數據：作者從TCGA下載level 3 DNA拷貝數數據，並使用Birdsuite進行處理。對數據進行清洗、標準化、分段和對數變換。
5）SNV 數據：作者使用VCFtools處理來自TCGA的level 3 SNV數據。
6）免疫基因集：分析所選擇的免疫基因集由812個基因組成。這組基因來源於與免疫系統相互作用的腫瘤細胞anti-genome 的meta分析。
3.生存分析：作者使用cox風險比模型、K-M分析來進行生存分析。
4.免疫組化分析：作者使用免疫組化分析LILRB1表達。
三．主要內容與結果：BCR相關的特徵
首先，作者為了識別與生化復發(BCR)相關的免疫基因相關特徵，使用R包mixOmics 的sPLS-DA模型分析每種組學數據。最終，作者識別出51個mRNA, 44個miRNA, 36個甲基化位點，32個CNA和6個SNV。從圖1中可以觀察到mRNA, miRNA,及甲基化預測BCR發生的平衡錯誤率（BER）良好, 然而CNA 及SNV沒有很好的預測BCR。接下來，作者將所有這些特徵合併到一個數據集中，並執行一個通用的sPLS-DA分析，結果發現能夠很好的預測BCR(圖2)。
圖1 來自TCGA 的單個組學數據集的sPLS-DA結果
圖2 TCGA 組學數據集的sPLS-DA結果
接下來作者分析識別了mRNA的特徵，發現一些特徵與抗原加工與呈遞有關，這其中包括HLA分子、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體、及LILR家族基因。由於LILR免疫調節因子家族，顯示出作為癌症免疫治療靶點的潛力，因此，作者進一步分析了30個LILR基因相關特徵與BCR之間的關聯。如圖3所示，可以觀察到在sPLS-DA分析中，僅30個LILR基因相關特徵就可以預測BCR，表明這個家族的受體在PCa的進展中發揮了作用。
圖3 TCGA 結合組學數據中LILR基因相關特徵的sPLS-DA結果
接下來作者為了進一步驗證LILR基因和BCR的相關性。作者整合171例腫瘤RNA-seq數據集分析使用Multivariate INTegrative (MINT)方法評估LILR基因與BCR的相關性。圖4展示了來自LILR基因家族的5個基因(LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB5和LILRA3)與BCR相關，證實了LILR基因與BCR之間存在關聯。
圖4 MINT分析結果
這一部分，作者為了進一步刻畫LILR基因和BCR的關聯，作者進行了K-M分析。圖5a可以看到，正如MINT分析所揭示的，LILRB1是一個與BCR密切相關的基因，因為LILRB1 mRNA的高水平與較短的BCR生存相關。此外，也可以觀察到高水平的LILRB2 mRNA也與較短的BCR生存相關，但這種關聯不那麼顯著(圖5b)。LILRB5 mRNA的高水平與較短的BCR生存幾乎顯著相關(圖5d)，而LILRB3 mRNA單獨表達與BCR生存無關(圖5c)。生信人進一步研究發現，將這4個基因的mRNA水平加起來，與BCR生存的相關性並不比單獨的LILRB1 mRNA更好(圖5e)，說明LILRB1是這種相關性的主要驅動因素。此外，將LILRB1從組合中去除會極大地影響該關聯顯著性，這也支持了LILRB1的重要性。相反，高水平的LILRA3 mRNA與較好的BCR生存顯著相關(圖5e)。
圖5 K-M分析LILR家族基因與BCR生存相關性
接下來，由於TCGA-GSE54460-VPC聯合隊列由高風險腫瘤組成，作者下一步試圖確定這些基因與BCR的相關性是否在中危PCa樣本隊列中保持不變。因此，作者使用由144名男性組成的亞隊列進行了新的Kaplan-Meier分析。圖6(b-d)顯示，高水平的LILRB2、LILRB3和LILRB5 mRNA水平與較短的BCR生存顯著相關。接下來，作者整合LILRB1、LILRB2、LILRB3和LILRB5 mRNA水平發現其總和與BCR相關（圖6e）。
圖6 CPC-GENE RNA-seq 數據中分析LILR家族基因與BCR生存相關性
由於在中等風險隊列中，LILRB1 mRNA水平與BCR之間沒有統計學意義上的顯著關聯，作者推測LILRB1基因的表達可能與grade有關。而Spearman相關分析也顯示，在TCGA-GSE54460-VPCC隊列中，LILRB1 mRNA水平與grade相關，而在聯合隊列中，LILRB2、LILRB3、LILRB5、LILRA3 mRNA水平與grade無關。為了進一步評估LILRB1基因與BCR的關係，作者通過免疫組化方法分析了20例高危前列腺腫瘤中LILRB1蛋白的表達。結果在分散於腫瘤腺體間的免疫細胞中發現了LILRB1蛋白。腫瘤細胞或基質細胞均未表達該蛋白。K-M分析也發現 LILRB1+細胞浸潤腫瘤臨床結局更差（圖7b）。
圖7 BCR生存分析
到這裡這篇文章的主要內容就介紹完了，文章使用PCa數據集進行了多組學分析，結合稀疏偏最小二乘判別分析、生存分析等生物信息方法識別了一系列與BCR密切相關的免疫特徵。並對這些特徵進行進一步分析最終確定一些候選分子靶點，這些分子靶點可以用於PCa的免疫治療幹預，而文章的亮點應該是整合了多組學數據進行分析，小夥伴們可以參考哦。