Nature Communications||綜述:突破PAM限制CRISPR-Cas核酸酶庫

CRISPR-Cas核酸酶需要通過與目標靶點互補的sgRNA以及靶點兩側的短序列(PAM)來識別靶標基因進而進行切割。其中PAM序列的靈活性大大限制Cas核酸酶的可靶向範圍。以常用具有很高的DNA裂解活性的SpCas9和SaCas9為例，它們所識別的PAM序列多含鳥嘌呤/胞嘧啶（G/C-rich），因此利用已報導的鹼基編輯系統無法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集（A/T-rich）區域進行精準鹼基編輯操作。特別是最常用的SpCas9酶，需要NGG PAM序列進行識別，以至於其作用限制僅為基因組的9.9％，靶向區域十分局限。

近日，研究人員在Nature Communications雜誌上發表了題為「CRISPR technologies and the search for the PAM-free nuclease」的綜述文章，作者綜述了目前為了擴大CRISPR工具的基因組靶向範圍而產生的一些具有新穎PAM偏好的Cas9變體和直向同源物。

如何尋找具有廣泛pam的Cas變體和直向同源物，我們不得不提到一個關鍵位點，PAM相互作用區 (PAM-interacting domain， PI)。PI結構域負責與目標DNA的PAM區相互作用，促進Cas9蛋白切割的特異性。Cas9 PI結構域非常靈活，可以對其進行蛋白質工程設計以識別涵蓋整個DNA核苷酸譜的多種序列基序。目前已經報導的如PAM序列放鬆為NGA（VQR變體），NGAG（EQR變體），NGCG（VRER變體）以及PAM識別序列為NG的xCas9和SpCas9-NG等。

除此之外，作者闡述了一系列不同PAM限制的核酸酶分支，並打破了原先-只有系統發育上不同的核酸酶才能識別出不同的PAM譜-這一假設，事實上PAM圖譜與核酸酶的系統並無直接關係，在密切相關的同源物之間，PAM差異也會很大。迄今為止，已在測序的基因組和元基因組64中鑑定出900多種不同的Cas9直系同源物。它們具有不同的PAM譜，蛋白質大小和最佳活性溫度，這些核酸酶的發現大大的擴展了基因組的可靶向範圍，拓寬了CRISPR工具的應用領域。

綜合來說，這些具有不同PAM序列的Cas核酸酶顯著提高了靶向範圍，為那些目前仍然無法進行基因組編輯的農藝性狀相關基因座提供了新的技術可能。 

原文連接: https://www.nature.com/articles/s41467-020-20633-y

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