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萜類化合物是目前已發現的數量最多的天然產物，其在香水、香料、抗腫瘤和抗瘧疾藥物中被廣泛應用。作為萜類化合物合成前體，線性異戊烯基焦磷酸能夠被不同的萜類合酶催化，形成多樣的萜類骨架。萜烯合酶催化的環化反應在很大程度上是導致萜類天然產物具有廣泛化學多樣性的主要原因。此外，異戊烯基焦磷酸還可以作為UbiA型以及ABBA型芳香族異戊烯基轉移酶的底物，合成異戊烯化的芳香族產物。然而到目前為止，還沒有證據表明這兩類酶在功能上存在交叉。
Fig. 1 Reaction products generated by AaTPS.
近期，武漢大學劉天罡老師在Naturecommunications上首次報導了萜類合酶隱藏的芳香異戊烯基轉移酶功能。作者課題組長期專注於萜類化合物的化學生物學研究，並在前期工作中成功構建了大腸桿菌、釀酒酵母等的萜類前體高效供給底盤，並基於此做了很多萜類化合物的挖掘工作。作者在絲狀真菌Alternariaalternate TPF6挖掘到一個沉默的Ⅰ型萜類合酶基因AaTPS，並將其導入萜類前體供給底盤E. coliC1中，成功的到了倍半萜類化合物1，並發現了由異戊烯基取代的吲哚類化合物2-4（Fig. 1）。
Fig. 2 Indole prenyltransferase activities of terpene cyclases.
於是，作者推測萜環化酶AaTPS在起到環化作用的同時，還起到芳基異戊烯基轉移的功能。並且作者將一些萜環化酶和芳基異戊烯轉移酶建進化樹分析，發現兩者在進化上並沒有關聯性。而在之前的文獻報導中，這些萜類合成前體IPP，DMAPP等過量積累對大腸桿菌是有毒性的，並且吲哚還是色氨酸的合成前體，而在紫杉二烯的表達系統中，吲哚與萜類化合物的濃度是呈負相關性的。根據這些信息，作者也想看一下這些AaTPS相關化合物的生成之間是否會存在一定關聯。於是選E. coli BL21作為對照，同時發酵萜類前體高產底盤E. coliC1，以及加入萜環化酶的E. coli GB230菌株，並在不同時段監測各類化合物的產量發現：吲哚的產量與萜類合成前提的產量是正相關的，而與色氨酸的產量是負相關的。基於此作者得出結論：當IPP/DMAPP累加到過量，對細胞產生毒性，響應於IPP/DMAPP毒性水平，萜環化酶隱藏的芳香異戊烯轉移酶活性被激活，利用掉多餘DMAPP和吲哚，以減輕細胞毒性（Fig. 1-3）。
Fig. 3. Accumulation of compounds in engineered E. coli strains.
後面作者又做了AaTPS的酶動力學研究，並發現AaTPS在偏中性條件下具有最優的萜環化功能，而在偏鹼性條件下具有最優的芳香異戊烯轉移功能。但從催化效率來看，催化環化的效率(kcat/KM= 0.14 s−1μM−1)是遠高於芳基異戊烯轉移功能(kcat/KM= 2.8×10−5s−1μM−1)的。而底物寬泛性實驗證明，AaTPS同樣可以以一些吲哚類似物為底物生成對應的異戊烯基取代產物（Fig. 2）。
Fig. 4 Structural comparison of AaTPS and other terpene synthases.
Fig. 5 Model of the FgGS–Mg2+3–DMAPP–indolecomplex.
為了進一步了解這些雙功能酶的催化機理，作者拿到了半萜合酶AaTPS和二萜合酶FgGS的晶體結構，並進行了一系列結構生物學研究，證實它們能夠在同一活性位點催化萜類環化和芳香異戊烯基轉移。並且推測了異戊烯基轉移的機理：首先，Mg+與DMAPP形成配位鍵使得DMAPP離子化，產生烯丙基碳正離子，隨後發生親電取代，吲哚烷基化形成C-C或C-N鍵。最後，PPi獲取吲哚碳正離子中間體上的質子，生異戊烯基取代吲哚產物（Fig. 4-6）。
Fig. 6Proposed mechanism of indole prenylation.
總結一下，通過體內和體外分析闡明了萜類合酶中隱藏的芳香異戊烯轉移酶的活性，證實這一功能在Ⅰ型萜類合酶家族中廣泛存在，並討論了其可能的催化機理及生物學意義。
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s41467-020-17642-2
文章題目：
Discoveryof the cryptic function of terpene cyclases as aromatic prenyltransferases
整理人：ZHJ
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