茶葉中咖啡因轉化為非刺激性茶氨酸的N9-甲基轉移酶的發現與鑑定

2021-02-12 生物催化夢工場

咖啡因是黃嘌呤生物鹼的主要成分，在許多受歡迎的飲料中十分常見。由於咖啡因偶爾會產生副作用，以自然的方式減少咖啡因具有重要的經濟意義。最近的研究表明，在稀有茶樹Camellia assamica var. kucha (Kucha)中，咖啡因可以轉化為非刺激性苦茶鹼，苦茶鹼具有鎮定、抗抑鬱、提高記憶力等諸多優點，且不會像咖啡因一般，引起焦慮、血壓升高等不良反應。苦茶鹼合成涉及咖啡因在C8的氧化和N9位的甲基化。然而，其潛在的分子機制仍不清楚。

來自暨南大學的何蓉蓉團隊在Nature communications發表了題為「Identification and characterization of N9-methyltransferase involved in converting caffeine into non-stimulatory theacrine in tea」的研究，鑑定了來自Kucha的苦茶鹼合成酶CkTcS，它以1,3,7-三甲基尿酸而不是咖啡因為底物，具有新的N9甲基轉移酶活性，證實了C8氧化發生在N9甲基化之前。CkTcS複合物的晶體結構揭示了N9甲基化所需的關鍵殘基，為茶樹中的咖啡因N-甲基轉移酶如何通過微調其活性位點來催化區域選擇性N-甲基化提供了見解。

作者首先分析了苦茶和普洱的黃嘌呤成分(圖1c)，發現苦茶中與普洱的黃嘌呤成分存在差異，苦茶葉中含有苦茶鹼，而普洱葉則沒有，顯示苦茶中可能存在一種甲基轉移酶，實現苦茶鹼的合成，通過提取全RNA並進行轉錄組測序，以茶葉來源的咖啡因合酶(具有N1、N3-甲基轉移酶活性)為探針進行BLAST分析，從中找到了N-甲基轉移酶的部分N端序列，通過PCR擴增得到三段甲基轉移酶序列，分別命名為CkCS、CkTbS、CkTcS。對這些酶進行進化樹分析及功能鑑定，發現CkCS、CkTbS分別為N1/N3和N3-甲基轉移酶，而CkTcS則具有N9甲基轉移酶活性，可以將咖啡因轉化為苦茶鹼。然而，該酶也在普洱中發現，但通過轉錄水平分析發現，普洱中的CkTcS表達量十分低，因此普洱中不含有苦茶鹼。

作者進一步解析了該酶的晶體結構，分析了該酶活性口袋胺基酸作用，發現T31對N9位甲基化的選擇性具有重要作用，R226、I241、C270則固定底物分子，使得攻擊構象更易形成。這些研究結果對無咖啡因飲料的開發具有一定的指導意義，為開發一種保留咖啡因風味及有益效用，並去除咖啡因的不良影響的飲品提供了新的思路。

圖1. 普洱、苦茶中主要黃嘌呤生物鹼的定性定量分析

論文：Y.-H. Zhang, Y.-F. Li, Y.-J. Wang, et al. Identification and characterization of N9-methyltransferase involved in converting caffeine into non-stimulatory theacrine in tea. Nature Communications (2020), https://doi.org/10.1038/s41467-020-15324-7.

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