ACS Catalysis | 分子模擬探究Mg離子介導的TrmD酶甲基轉移過程

引言

TrmD是一種細菌特異性的甲基轉移酶。Mg離子是TrmD的發揮催化活性所必需的，但目前對TrmD結構中Mg離子的位置及其發揮的作用尚不清楚。研究人員通過分子動力學（MD）模擬，確定了酶活性位點合理的Mg離子結合口袋，Mg離子和兩個天冬氨酸和一個穀氨酸以及S-腺苷甲硫氨酸（SAM）協調作用。通過實驗突變研究驗證了計算結果，該研究證明了Mg離子結合殘基對於催化活性的重要性。量子力學計算表明，只有當Mg束縛在模擬代表性結構的位置上時，才會發生甲基轉移過程，該研究為基於靶向Mg離子結合TrmD 的抗菌藥物發現提供了新的策略。

背景

甲基轉移反應在多種生理過程中起著至關重要的作用。他們最經常使用甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）進行甲基轉移。SAM的甲基是帶電荷的moiety部分的一部分，其熱力學不穩定，使甲基取代基對親核試劑具有高度反應性。因此，通常在沒有金屬離子協助的情況下發生由甲基轉移酶催化的甲基轉移。即使在需要金屬離子的極少數情況下，它們的作用通常也僅限於穩定底物和提高選擇性，但不直接參與化學鍵的實際斷裂和形成。例如，這與激酶催化的磷醯基轉移反應相反，後者嚴格要求二價金屬離子使ATP的γ-磷醯基相對於底物「在線」取向，以形成正確的催化幾何結構。

兩個高度保守的胺基酸D169和R154對於TrmD活性展現發揮重要的作用，D169能從G37的N1中提取質子；R154能夠和帶負電的D37形成穩定的相互作用。但是，由於TrmD晶體結構均不含Mg離子，催化機理的細節仍不清楚，依賴Mg離子的催化過程也難以通過光譜研究，研究人員因此採用分子動力學（MD）模擬和量子力學（QM）結合的計算方法來探究Mg離子與酶的確切結合位置及其在催化中的作用

模擬結果

1：Mg離子在TrmD的活動位點優先結合

TrmD的每個單體都包含兩個域（N和C端）和它們之間的柔性連接子。催化三聯體嵌入在N末端結構域中（圖1）。TrmD與其他甲基轉移酶的區別在於，一次僅可操作一個活性位點，每個二聚體僅結合一個tRNA。

圖1. TrmD-tRNA-SFG複合物的晶體結構

圖片來源 ACS Catalysis

在模擬中，Mg離子自發地和結合到兩個複合物的活性位點，但位置出乎意料。Mg離子和三個酸性殘基（E116,D169和D177）的羧基相互作用，而與G37並無相互作用（圖2A）。此外，研究人員對TrmD複合物結構進行了類似的模擬，此時體系中沒有Mg離子的條件下， Na +離子是溶劑中僅有的帶正電的離子。模擬結果表明Na+也經常出現在結合位點。但與Mg離子相比，它可以同時結合兩種單體上 （圖2B）。儘管在TrmD的晶體結構中未發現Mg離子，但由於Mg離子（和Na +）與水分子之間的電子密度相似，因此存在這樣的可能性：被誤認為結晶水。實際上，有一些例子表明Mg離子和其他離子被錯誤地識別為水。 因此，使用表徵水分子與周圍原子之間相互作用數量的方法，研究人員根據TrmD的X射線結構中研究了結晶水，發現水分子的位置對應於研究人員在MD模擬中確定的Mg離子和Na +的位置（圖2 C）。在每種情況下，水都與SAM和酸性殘基的羧酸基團接觸，這表明它們實際上可能是金屬離子。此外，TrmD-tRNA-SFG（PDB ID：4yvi）的晶體結構在配體的蛋氨酸部分附近包含未分配的電子密度（圖2 D）。它的位置幾乎完全對應於通過上述程序確定的水的位置。因此，結晶水可能是被研究人員一直忽視的與酶結合的金屬離子。

圖2. TrmD的活動區域

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2：Mg離子結合改變活性部位的構象

為了評估Mg離子TrmD的結構，研究人員對複合物進行了10次獨立的MD模擬，並從一開始就將Mg離子放置在事先確定的結合位點。在模擬過程中，沒有觀察到金屬離子離開結合位點，因為和周圍的負電荷的殘基的羧基形成了靜電相互作用。模擬表明，Mg離子的存在改變了活性位點的結構。最值得注意的是，D169遠離G37，殘基之間的距離達到5.5 Å，從而允許水分子存在於兩者之間。此外，R154遠離G37 的O 6原子， SAM的甲基也遠離G37 的N 1原子（圖3）。

圖3. TrmD活性位點的重要距離取決於正離子的存在和位置

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Mg離子結合的影響超出了活性位點殘基位置的改變。TrmD與SAM的二元複合物的模擬表明，Mg離子對於促使甲基供體形成彎曲的構象也至關重要。儘管在沒有tRNA的情況下，SAM的甲硫氨酸部分在活性位點相當靈活，在開放構象和彎曲構象之間轉移，但其通過羧酸酯基與Mg離子配位穩定了彎曲結構。相反，當存在的是Na +時無法形成這種穩定作用，而Na +在模擬中大大促進了開放構象（圖4）。因此，Mg離子通過影響SAM的構型來影響催化的過程。由於開放和彎曲構象之間的轉換，研究人員探究了Mg離子結合改變了這兩種狀態下SAM結合的能量。研究人員分析了TrmD中SAM處於開放狀態和彎曲狀態的氫鍵網絡，發現兩個狀態中氫鍵的數目大致恆定，這與先前觀察到的Mg離子結合不影響SAM對酶的親和力一致。但是，研究人員觀察到兩種狀態的氫鍵類型不同，反映了它們之間的差異。例如，SAM中甲硫氨酸部分的氨基與D177 *的羧酸根之間的氫鍵對彎曲形式具有特異性，而R154 *與SAM的羧基之間的氫鍵則對開放形式具有特異性 。因此，Mg離子結合甚至在tRNA結合之前就將甲基供體約束為彎曲構象。

圖4. 包含鎂離子(左圖）和不包含（右圖）時全酶模擬時，SAM構象空間的自由能勢能面

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3：量化（QM）計算

MD模擬的結果顯示，Mg離子優先結合到活性位點的帶負電荷的口袋，該口袋由E116，D169 *，D177 *和SAM的羧酸鹽組成。研究人員從MD模擬中為金屬離子的這個位置選擇了8個不同的代表構象，並使用它們來構建用於QM計算的活動位點模型。在能量上最有優勢的模型（就能壘高低而言）由9個胺基酸（P58，G59，E116，V137，L138，T139，R154 *，D169 *，D177 *），SAM，G37和五個水分子組成（總共194個原子）。在初始構型中，Mg離子通過D169 *，D177 *和SAM的羧酸鹽的氧原子和三個水分子進行配位，並在整個反應步驟中保持排列。在該模型中，D169 *與G37 的N 1質子通過橋接的水分子相互作用。質子從G37 的N 1轉移到D169 *的羧酸鹽的能壘為8.5 kcal / mol（TS1，圖5）。最終的中間結構是優化過程中的最小能量，在進行零點能量（ZPE）校正後，該中間結構比先前的過渡狀態提高了約1 kcal / mol 。質子轉移後，質子化的D169 *離開G37，與SAM的羧酸基團形成氫鍵。在O 6原子產生的負電荷被R154 *穩定，R154 * 在此階段通過氫鍵和堆積與核鹼基直接相互作用。

圖5. 取決於金屬離子位置的甲基轉移反應通路能量圖

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結論

使用MD模擬和QM計算的組合方法，研究人員研究了Mg離子的結合位點，並揭示了其催化潛力。在MD模擬中，Mg離子優先與帶負電荷的口袋中的酶的活性位點結合，並誘導催化胺基酸殘基和SAM甲基供體的構象變化。QM計算證明，只有在Mg離子結合獲得的幾何形狀中，活性位點才具有催化作用。這些結果還通過實驗性突變研究得到了驗證，該研究證明了Mg離子的重要性-結合殘基用於催化活性。從方法論的角度來看，這項工作也很重要。它提供並驗證了一種策略，該策略整合了MD模擬和QM計算各自的優勢，來研究Mg離子依賴的反應，其中難以用光譜學方法研究金屬離子常常掩蓋了對催化機理的認識。

參考文獻

Agata P. Perlinska, Marcin Kalek,* Thomas Christian, Ya-Ming Hou,* and Joanna I. Sulkowska*, Mg2+-Dependent Methyl Transfer by a Knotted Protein: A Molecular Dynamics Simulation and Quantum Mechanics Study. ACS Catal. 2020, 10, XXX, 8058–8068

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