前言
粘蛋白型（GalNAc型）O-糖基化（以下簡稱O-GalNAc糖基化）是具有重要生物學功能的翻譯後修飾類型 [1-3]。近年來，許多研究表明蛋白質特異性位點的O-GalNAc糖基化與腫瘤、神經退行性疾病等多種嚴重威脅人類健康的疾病密切相關, 如冠狀動脈疾病，阿爾茨海默氏病 [4-5]。ppGalNAc-T酶是O-GalNAc糖基化修飾的起始糖基轉移酶，在人體中，ppGalNAc-Ts家族由20種同工酶組成，根據其相似性分為Ia，Ib，Ic，Id，Ie，If，Ig，IIa和IIb七個亞家族。ppGalNAc-T酶通過對底物位點的選擇性催化，精密調控蛋白的O-GalNAc糖基化。已有研究報導，ppGalNAc-T酶催化結構域的catalytic loop在整個催化反應中至關重要。O-GalNAc糖基化的第一步是由一大類稱為多肽N-乙醯半乳糖胺基轉移酶（ppGalNAc-Ts）的酶完成的，該酶將GalNAc組從UDP-GalNAc轉移到蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基，得到產物TN（GalNAcα1-O-絲氨酸/蘇氨酸）和抗原釋放出遊離UDP。
對於ppGalNAc-Ts體系，前人通過600ns的分子模擬來研究catalytic loop的構象轉變。他們的結果表明，loop的閉合是與UDP-GalNAc結合引起。但研究未能揭示loop打開/閉合的完整動態過程，這個過程可能發生在數十微秒甚至更長的時間尺度內。
本項研究中，研究人員採用了長時間的分子模擬（約20μs），來研究模擬過程中UDP-GalNAc結合後T2中完整的catalytic loop打開/閉合的過程，模擬的結果捕捉到3個關鍵的構象變化中間態。另外，本研究發現，活性位點附近的若干胺基酸殘基對調控catalytic loop的動力學過程起到關鍵作用，進而影響後續的底物識別。更進一步，結合計算的結果，研究人員對若干胺基酸位點進行了突變實驗，並測定了它們的酶動力學、親和力參數及糖基化位點。本研究揭示了catalytic loop在底物識別和糖基化位點選擇性上的關鍵作用。
如何在分子模擬中構造馬爾科夫模型（MSM）
最近2年，在分子模擬領域，對於感興趣的構象變化的問題處理，研究，通過大量短時間MD模擬，構造馬爾科夫狀態模型（MSM）的方式被證明是行之有效的方法 [6] 。
構建MSM模型，一般要選擇n個狀態，使得它們涵蓋了整個動力學行為，並且滯後時間τ足夠長以成為馬爾科夫模型，但又短得足以解決系統動力學問題。如果能夠成功做到這一點，則MSM僅從其過渡矩陣提供有關系統的有價值的信息， 如下圖所示，a圖表示的是八段不同的短時間的模擬軌跡，每一段模擬中可以選取不同幀的由一個模擬時間步分開。B圖表示將軌跡分解為若干離散狀態，其中已識別出四個狀態（綠色，藍色，紫色和粉紅色）。C圖表示的是觀察到的轉換計數矩陣，d圖是可逆轉換概率矩陣，，通過對觀察到的轉換計數矩陣及其轉置進行平均得到，以確保每個正向轉換都可以發生相同次數的向後轉換。每行的概率總計為1。e圖是總體概率分布的餅圖，這是概率矩陣的第一個特徵向量。佔比比較高的狀態在熱力學上也更趨於穩定。F圖是軌跡數據集主要特徵過程的示意圖。綠色狀態的特徵通量為負，而所有其他狀態的特徵通量為正，因此此過程表示從綠色狀態向其他狀態的運動。總體總和為1，每個過程的特徵通量總和為0。此過程的時標是五個軌跡時間步長。
圖1：馬爾科夫模型構建的方法
圖片來源自J. Am. Chem. Soc
本文構造馬爾科夫模型的過程
研究人員通過tICA降維和聚類分析，將199條時長 100-ns MD模擬的所有構象聚類為不同數量的微狀態。然後，為了研究catalytic loop閉合過程中動力學的詳細機制，進一步使用PCCA +算法將一個500狀態的動力學模型歸納為5個宏觀狀態，隨後使用不同的仿真數據集進行MSM的收斂性測試。
結果
catalytic loop打開→閉合過程中關鍵亞穩狀態的發現
通過構建MSM模型，研究人員發現在閉合過程中識別出catalytic loop的五個亞穩態，即S1-S5（圖2 A，B）。S1和S5狀態分別對應於完全打開和完全關閉的狀態，其他三個狀態是loop閉合期間的關鍵中間狀態。進一步分析過渡路徑，揭示了兩個主要的構象轉變途徑：S1→S2→S3→S4→S5和S1→S2→S3→S5（圖2 C）。S1的結構特徵類似於最初的開環構象，和主鏈的I253殘基形成一個穩定的氫鍵（佔71.3％）（圖2 d，3 A，B，E，F）。從S1開始，catalytic loop首先過渡到S2狀態，其中Y367失去與I253，W282和F361的相互作用，catalytic loop的結構朝向UDP-GalNAc的構象。然後S2可以進一步過渡到S3，在此期間catalytic loop到達接近封閉構象的區域，並且H365，Y367和F369的側鏈可以與V330，W331，F377，L204，H145和UDP-GalNAc的尿嘧啶形成疏水作用（見圖2 D，3 E）。
最終，從S3狀態，catalytic loop可以直接轉變到閉合的狀態S5，或者經過另一個中間狀態S4, 到達S5狀態（見圖2 C）。S5是完全閉合狀態，其中H365，Y367，F369，F377，H145，L204，V330，W331和UDP-GalNAc的尿嘧啶基團可以形成穩定的疏水區域（見圖2 D，3 E ，F）。這些相互作用網絡有助於將catalytic loop穩定在封閉狀態。
圖 2:MSM模型確定了catalytic loop在閉合過程中存在5個亞穩態。（A）在前兩個最慢tIC維度上，模擬中構象的自由能投影。（B）兩個最慢的tIC上，模擬中構象的散點分布圖。S1到S5分別用黑色，紅色，綠色，藍色和橙色表示。（C）源自MSM的五態動力學模型，每個圓圈代表一個亞穩態（D）每個宏觀狀態下具有代表性的構象展示
圖 3: catalytic loop 閉合過程中關鍵的結構變化。（A）六個關鍵氫鍵在模擬過程中所佔有的概率（B）每個亞穩態的HB佔據H1，H2，H3，H4，H5和H6。（C）在每種狀態下，催化環C末端區域螺旋佔有的概率（D）距UDP–GalNAc小於3的距離內的水分子數量。（E）距離計算時幾個殘基對的定義（F）在每個亞穩態下d1，d2，d3，d4，d5和d6的測量距離。
圖片來源自ACS catalysis
為了更好地觀察監控整個loop閉合的過程，研究人員將所有MD的構型投影到第一個tIC以及迴轉半徑（Rg）上。如圖4 A 所示，在loop閉合期間，Rg的平均值從S1狀態時的~10 減小到S5狀態時的~7 。具體地，在S1中，W331，H365，Y367和F369的位置比較分散，形成了相對較高的R g值（見圖3 E，F和4），等到了S5狀態，完全閉合的構象S5顯示出所有五個狀態中均顯示出最低的R g值（請參見圖4）。
圖4. S2是catalytic loop關閉動力學的關鍵中間狀態。（A）散點圖，每個MD構象都映射到第一個tIC上，H145，L204，V330，W331，H365，Y367，F369，F377和UDP的尿嘧啶部分（Ura）的迴轉半徑(Rg) (B)每個狀態（S1-S5）的代表性結構展示。
圖片來源自ACS catalysis
UDP-GalNAc結合綁定促進了Catalytic-Loop的關閉
有趣的是，本項研究發現佔比最高的狀態不是閉合的狀態S5, 而是中間態S2。分析表明，S2中catalytic loop的構象非常不均一，既包含開放的構象（有較高的R g值），也包含封閉的構象（較低的R g值，見圖4 A）。而在到達S3之後，catalytic loop漸漸趨向閉合的狀態，綜合以上結果，研究人員推測S2是催化環閉合動力學的關鍵中間狀態，在這期間，UDP-GalNAc可能參與促進了catalytic loop從開放形式向封閉形式的構象轉變。為了驗證這個假設，研究人員對apo T2結構（不與UDP-GalNAc結合的構象）進行了額外的模擬，目的是為了研究UDP-GalNAc在閉合過程中的作用。結果表明，UDP-GalNAc的存在可以使catalytic loop穩定在起始構象，甚至可以促進loop的閉合。相反的，當沒有UDP-GalNAc之後，大約一半模擬的構象趨向轉變為開放狀態。進一步的分析表明，與UDP-GalNAc直接接觸的幾個關鍵殘基，包括L204，V330和W331，在去除UDP-GalNAc之後經歷了較大的結構波動。
圖5. UDP–GalNAc的存在促進了催化環的閉合。
圖片來源自ACS catalysis
結語
本項研究中，研究人員通過廣泛的計算模擬，揭示了在UDP-GalNAc結合後T2中catalytic loop的閉合/打開運動的完整動力學過程。構建的馬爾科夫模型（MSM）可以識別催化環在其閉合運動過程中的五個關鍵中間狀態，這在之後的識別底物和後續的催化反應中起到了關鍵的作用。
參考文獻：
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