CRISPR/Cas9基因組編輯技術由於簡便性和高效性，已經被廣泛應用於生物學、醫學、農學等領域的基礎與應用研究。目前最廣泛使用的釀膿鏈球菌Cas9（Streptococcus pyogenesCas9，SpCas9），由於脫靶性、細胞毒性、大尺寸（1368個胺基酸）、和嚴格的PAM識別等性質嚴重限制了其在疾病治療等領域的應用。發掘和改造來自不同物種中的Cas9核酸酶是解決目前CRISPR/Cas9技術問題的一種行之有效的方法。嗜熱鏈球菌St1Cas9是最早發現的Cas9核酸酶之一，具有尺寸小（1121個胺基酸，適用於單個AAV載體組裝）、脫靶率低、低細胞毒性等優點，並且近年來報導了其在哺乳動物細胞中具有較高的基因編輯活性，具有潛在的臨床應用價值，然而其嚴格的PAM識別特性限制了其可編輯的位點。
近日，上海科技大學季泉江課題組與復旦大學甘建華課題組合作在Nature Catalysis發表了題為「Catalytic-state structure and engineering ofStreptococcus thermophilus Cas9」的研究論文，解析了Cas9核酸酶罕見的催化狀態結構，揭示了嗜熱鏈球菌Cas9核酸酶（Streptococcus thermophilusCas9，St1Cas9）的催化機制和PAM DNA識別機制，並基於這些機制進化拓展了St1Cas9 PAM DNA識別，為Cas9核酸酶工作機制的理解和定向進化奠定了重要基礎。
St1Cas9不同於其它Cas9核酸酶的生物化學性質暗示其不同的DNA識別和催化機制。為了闡明St1Cas9的工作機制，研究人員成功解析了St1Cas9-sgRNA-DNA的三元複合物晶體結構，並且意外發現其中的Cas9核酸酶處於DNA切割的催化活性狀態，清晰揭示了HNH核酸酶結構域切割DNA靶向鏈的分子機制(圖1)。
圖1. HNH核酸酶結構域催化狀態結構
Cas9的HNH核酸酶結構域具有較高的柔性，因而在目前解析的Cas9複合物結構中，HNH核酸酶結構域大多處於非活性狀態。進一步分析發現，St1Cas9具有獨一無二的「wing」區域。wing區域主要由兩個β摺疊組成，通過氫鍵、鹽橋以及範德華力將HNH核酸酶結構域穩定在活性狀態，起到調控St1Cas9切割活性以及脫靶活性的作用(圖2)。
圖2. wing區域的性質與功能
該研究同時揭示了St1Cas9識別不同PAM DNA的分子機制。不同於目前已有的Cas9家族的PAM識別機制，St1Cas9同時運用氫鍵和範德華力來識別較為複雜的NNAGAA PAM DNA(N為任意鹼基)，豐富了Cas9家族PAM識別機制(圖3)。
圖3. PAM DNA識別機制
為了拓展St1Cas9 PAM DNA識別，研究人員依據其分子機制進行定向進化，通過引入D939K/E1057L/N1081K/K1086L這四種胺基酸突變，構建了St1Cas9的KLKL變體，消除St1Cas9對PAM DNA第四號位鹼基特異性的相互作用並補以非鹼基特異性的相互作用，成功地將St1Cas9的PAM識別範圍從野生型的NNAGAA拓展為NNRNAA（N為任意鹼基，R為A或G鹼基），擴大了St1Cas9的基因編輯範圍，具有更為廣闊的應用前景(圖4)。
圖4. St1Cas9定向進化
季泉江課題組博士研究生張翼飛和張洪源分別為論文第一、第二作者，季泉江教授和復旦大學甘建華教授為論文共同通訊作者。
原文連結
https://www.nature.com/articles/s41929-020-00506-9
來源：BioArt