中國人自己的MSI檢測 | 凡是過往 皆為序章

01

尋根

微衛星到底是什麼？

科學家們發現,在人類基因組中分布著許多重複的DNA序列，這些序列大多位於基因與基因之間，因此它們在不同個體間的序列長度雖然不盡相同，但是不會影響個體間遺傳功能的改變。這些高度重複的核苷酸序列DNA通常被稱為衛星DNA。

微衛星(microsatellite，MS)，也稱為短串聯重複序列（Short tandem repeat，STR），是人類基因組中少數幾個核苷酸重複（通常是1~6個，或者更多）的現象。

STR 具有種屬特異、遺傳穩定的特點，使其在人類基因組遺傳圖譜的製作、癌症診斷、親緣關係分析、法醫學個體識別等領域都得到了廣泛的應用。

02

必然

MSI與錯配修復

MMR基因突變或者基因修飾（如甲基化），導致MMR蛋白功能缺失，當機體中的錯配修復功能發生缺陷時，由於微衛星多次重複的特點更傾向出現複製錯誤，導致微衛星的缺失或插入，從而發生了微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）。

這種不穩定的狀態連同MMR基因的缺失導致細胞內突變累積加速，進而引起致癌或抑癌基因表達調控變化，發生癌變。

微衛星不穩定狀態可以用來進行腫瘤輔助診斷。

在結直腸癌的分子分型中，微衛星不穩定狀態是一種重要的分型工具，幫助臨床醫生就疾病提出診斷和治療方案。

來源：World J Gastrointest Oncol. 2013 Feb 15; 5(2): 12–19.

在《結直腸癌及其他相關實體瘤微衛星不穩定性檢測中國專家共識》中，推薦對所有結直腸癌患者進行MMR蛋白/MSI檢測，以明確患者是否屬於林奇症候群。

林奇症候群是一種常染色體顯性遺傳疾病，由於錯配修復基因的遺傳性變異導致。90%以上的林奇症候群患者發生了微衛星不穩定的情況。目前的林奇症候群的篩查面臨著漏診的問題，除了擴大對林奇症候群篩查的腫瘤譜之外，提高試劑的靈敏性，降低漏診率也是臨床急需解決的問題。

03

疑問

如何選擇微衛星檢測位點？

MSI確定除直接檢測MSI外還可以通過MMR基因突變（或表觀遺傳學修飾分析）、二代測序方法以及MMR免疫組化檢測實現。其中免疫組化檢測最為簡便，並且可以提供基因異常的線索。但免疫組化的判讀需要檢驗醫生具有比較豐富的閱片經驗和病例積累，二代測序從成本和周期上暫時不具有優勢。

用毛細管電泳的方法檢測微衛星不穩定位點，面臨的首要問題是「測哪個/哪些微衛星位點呢？」

為此，從1993年Aaltonen等人首次在家族性遺傳性結直腸癌（HNPCC）中發現高頻率的MSI現象（約90%的Lynch症候群患者存在MSI-H現象）開始，人們就開始尋找靈敏度高、特異性好的檢測靶標。

選擇合適的微衛星位點是MSI檢測準確性的重要因素之一。結合文獻研究和行業研究，匯總MSI檢測的影響因素如下：

• 微衛星類型（單-，雙-，三-核苷酸）：單核苷酸的微衛星具有更高的靈敏性，有研究表明隨著微衛星核苷酸數量的增加，靈敏性呈逐漸下降的趨勢；

• 微衛星位點數量：並不是數量越多越好，增加微衛星可能會降低檢測的靈敏性；

• 微衛星在腫瘤中的不穩定檢出率：陽性率越高的微衛星趨於有更高的靈敏性；

• 微衛星位點的多態性：更傾向於單態的微衛星，可以降低結果判讀的複雜性，增加判讀的準確性；

• 檢測體系的兼容性：待檢測的微衛星是否可以做到單管擴增，以實現操作簡便、減少誤差的目的。

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歷史

站在巨人們的肩膀上

早在1997年，在美國國家癌症研究所（National Cancer Institute,NCI）提出了5個微衛星的評價系統，包括：BAT-25,BAT-26,D5S346,D2S123,D17S250,其中D5S346, D2S123, D17S250為雙核苷酸微衛星。

2002年，Suraweera等的研究發現雙核苷酸位點在MSI-H的檢出率只能到60%~80%，而且雙位點核苷酸本身更趨於不穩定，對結果圖譜判讀的難度增大，容易得到錯誤的分類結果。他們研究出的pentaplex體系，含有5個單核苷酸位點（BAT-25,BAT-26，NR-21,NR-22,NR-24), 檢測靈敏性均在95%以上。在該團隊後續的研究中，NR-22由於擴增兼容性問題被NR-27替代。

2004年Bethesda指南中指出了pentaplex體系的高靈敏性和特異性，同時指南中還提出可以選擇一些多核苷酸位點作為內對照防止樣品間的混淆。

2006年，國外某廠家（以下簡稱「A公司」）的7位點MSI檢測體系出現，包括5個單核苷酸位點（BAT-25,BAT-26，MONO-27,NR-22,NR-24）和2個對照位點（PentaC,PentaD）。該體系中使用MONO-27替代了NR-22。至此，基於PCR法中的5~7個標誌位點組合被認定為PCR-MSI檢測的金標準。

結合前輩們的研究數據和行業指南，我們最終選擇了一個6種單核苷酸重複的組合，如下：

這些位點涵蓋了幾乎所有的經典可靠的微衛星位點，如下圖：

為什麼單核苷酸重複位點具有更高的靈敏度和特異性呢？

為此我們也進行了一些探究，可能的原因如下：

A：單核苷酸重複位點更傾向單態

單核苷酸微衛星通常存在於一些基因的非翻譯區或5』UTR或3』UTR 區域，由於一些不明確的原因，有些單核苷酸的微衛星是更傾向於單態的。研究表明BAT-25,BAT-26,NR-21,NR-22,NR-24位點在高加索人中的多態性均不到1%，是接近單態的位點。

閱微基因前期在327個中國人群中的研究發現，以下6個位點的雜合度在1%~10%之間。

B：選擇的Microread MSI Panel與基因轉錄調控功能相關

同時，這些位點所在的基因參與了基因轉錄調控功能、腫瘤的發生和凋亡及錯配修復等，進一步驗證了微衛星不穩定狀態可能通過影響上述基因的表達調控引發腫瘤的發生。

C：Microread MSI Panel與染色體的覆蓋情況

為了使這些微衛星位點能夠更好的代表腫瘤的微衛星不穩定狀態，在保證檢測簡潔、靈敏度、特異性好的基礎上，這些位點在染色體上的分布如下圖，我們儘可能覆蓋不同的染色體。

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金標準

凡是過往 皆為序章

為了驗證六位點MSI panel的靈敏度與特異性，閱微基因進行了大量臨床樣本的驗證。我們從微衛星的位移值檢測的準確性和漏診率等不同方面，對試劑盒的性能進行了分析和驗證。

A：微衛星不穩定位移值與MSI檢測

微衛星的位移值，指的是發生微衛星不穩定的樣本中，某一個STR位點腫瘤組織與正常組織核苷酸重複數之間的差異。

在354個腫瘤樣本中，經IHC檢測，其中有171例為MSI-H，183例為MSS/MSI-L。從圖中可以看出，微衛星位移在MSI-H與MSS/MSS-L中差異顯著，在MSS中的位移接近基線水平，NR-27和BAT-26的位移最大，推測會有較高的靈敏性。

下圖中可以直觀的看到每個個體的位移情況，1-171為MSI-H樣本中的位移情況，172-354為MSS/MSI-L樣本中的位移情況，通過比較位移可以對不同的微衛星狀態進行判斷，說明通過毛細管電泳檢測位移的方法，可以輕鬆實現對個體MSI狀態的分析。

B：單核苷酸重複位點不同組合panel與MSI檢測

閱微基因參考A公司的體系構建了MR-Panel1（無NR-27），參考Bethesda推薦的pentaplex體系構建了MR-Panel2(無MONO-27)，整合了A公司和pentaplex體系構建了MR-panel3（6核心位點），比較3個不同panel的檢測準確性和特異性。

中國人群中，從單個位點來看，NR-24靈敏性較低，但特異性為100%。NR-27的靈敏性、特異性、準確性是6個位點中最佳的。3個panel的檢測準確性都在95%以上，以MR-Panle3的靈敏性和準確性最高。當採用MR-Panle3時，檢測的漏診率為2.34%，相比於MR-Panle1和MR-Panle2分別降低了1.75%和2.34%。

C：六單核苷酸重複位點的Microread MSI Panel的中國人群驗證結果

658例臨床結直腸癌樣本及其對應癌旁組織，分別使用Microread MSI Panel和免疫組織化學方法進行對比檢測，結果如下：

和免疫組織化學的結果相比，總符合率為96.61%（95%CI：94.15%~98.24%），Microread MSI Panel具有很高的靈敏度和特異性。

結束語

閱微基因在CE平臺上有著豐富的研發經驗，一直處於國內前沿，可以非常精準地對單核苷酸的微衛星狀態進行判讀。Microread MSI Panel（MR-panel3，6核心位點）在檢測技術和臨床應用上都有獨特的優勢，閱微基因結直腸癌微衛星不穩定狀態檢測試劑盒已經遞交了國家第三類體外診斷試劑的註冊申請。相信在不久的將來該試劑能夠應用到臨床，切實地為患者服務。

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中國醫師協會結直腸腫瘤專業委員會遺傳專委會.《結直腸癌及其他相關實體瘤微衛星不穩定性檢測中國專家共識》.

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