發酵飼料分析檢測技術

近年來，生物飼料研究與應用已經成為飼料行業研究的熱點。《農業部「十三五」規劃》也明確提出生物飼料產業對促進農副資源飼料化與高效利用、推動飼料配方體系的變革、改善動物生產性能、降低養殖成本、實現從減抗到無抗養殖、減排環保等具有重要意義。

生物飼料是未來發展方向，目前我國從事生物飼料行業的企業數量已經有1000 多家，微生物飼料添加劑和酶製劑產量已經超過20 萬t，發酵飼料產品產量110 多萬t，增幅超過20%。國家對於發酵飼料的質量標準與控制，也在不斷的規範發展。生物飼料領域第1 個團體標準T /CSWSL 001—2018《生物飼料產品分類》於2018 年1 月1 日發布，《發酵飼料技術通則》、《飼料原料釀酒酵母培養物》、《飼料原料釀酒酵母發酵白酒糟》和《飼料添加劑植物乳桿菌》4 項團體標準於2018 年9 月7 日發布，對規範我國生物飼料產業自律性和行業健康發展意義重大。

1 飼料原料

1.1 發酵飼料

《飼料原料目錄》中含有12 類：穀物及其加工產品，油料籽實及其加工產品，豆科作物籽實及其加工產品，塊莖、塊根及其加工產品，其它籽實、果實類產品及其加工產品，飼草、粗飼料及其加工產品，其它植物、藻類及其加工產品，乳製品及其副產品，陸生動物產品及其副產品，魚、其它水生生物及其副產品，礦物質，微生物發酵產品及副產品。

生物飼料，總體來講，要使用在我們允許的飼料目錄和添加劑裡的原料，通過生物工程技術，進行處理，包括發酵飼料、酶解飼料、菌酶協同發酵飼料和生物飼料添加劑。

使用《飼料原料目錄（2013）》和《飼料添加劑品種目錄（2013）》等國家相關法規允許使用的飼料原料和微生物，通過發酵工程技術生產、含有微生物或其代謝產物的單一飼料和混合飼料。鑑於生物飼料添加劑種類繁多，本文僅就發酵飼料的檢測技術進行綜述。

1.2 常規檢測指標

《GB/T 6435 飼料水分的測定》、《GB/T 12456 食品中總酸的測定》、《GB/T 6432 飼料中粗蛋白測定方法》、《GB/T 643 飼料中粗脂肪的測定》、《GB/T 6434飼料中粗纖維的含量測定過濾法》、《GB/T 6438 飼料中粗灰分的測定》、《GB/T 18246 飼料中胺基酸的測定》、《GB/T 22492 大豆肽粉》、《GB/T 6439 飼料中水溶性氯化物的測定》、《GB/T 13885 飼料中鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、鈉和鋅含量的測定》、《GB/T 20806飼料中中性洗滌纖維(NDF)的測定》、《NY/T 1459 飼料中酸性洗滌纖維的測定》、《GB/T 17817 飼料中維生素A 的測定 高效液相色譜法》、《GB/T 20194 動物飼料中澱粉含量的測定 旋光法》。

1.3 衛生指標

《GB 13078 飼料衛生標準》、《GB/T 13079 飼料中總砷的測定》、《GB/T 13080 飼料中鉛的測定》、《GB/T13092 飼料中黴菌總數測定方法》、《GB/T17480 飼料中黃麴黴毒素B1 的測定方法》、《GB/T 30956 飼料中DON 測定》、《GB/T 28716 飼料中玉米赤黴烯酮的測定》、《GB/T 18869 飼料中大腸菌群的測定》。

1.4 微生物指標

《GB/T20191 飼料中嗜酸乳桿菌的微生物學檢驗》、《GB/T26428 飼用微生物製劑中枯草芽孢桿菌的檢測》、《 NY/T 2131 飼料添加劑 枯草芽孢桿菌》、《NY/T 1461 飼料微生物添加劑地衣芽孢桿菌》、《NY/T 1969 飼料添加劑 產朊假絲酵母》、《GB/T22547 飼料添加劑 飼用活性乾酵母》、《GB 4789.2 食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》。

1.5 規則規範

《飼料原料目錄》、《飼料添加劑品種目錄》、《飼料添加劑安全使用規範》、《JJF1070 定量包裝商品淨含量計量檢驗規則》、《定量包裝商品計量監督管理辦法》、《GB 10648 飼料標籤》、《GB/T 14699.1 飼料採樣》、《GB/T 16764 配合飼料企業衛生規範》、《GB/T 10647 飼料工業術語》、《GB/T 20195 動物飼料 試樣的製備》、《GB/T 18823 飼料檢測結果判定的允許誤差》。

1.6 延伸檢測指標

《GB/T 5009.157 食品中有機酸的測定》、《NY/T2796 水果中有機酸的測定 離子色譜法》、《GB/T23881 飼用纖維素酶活性的測定 濾紙法》、《NY/T912 飼料添加劑 纖維素酶活力的測定分光光度法》、《 GB/T 28715 飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定 分光光度法》、《NY/T 1372-2007 飼料中三聚氰胺的測定》。

2 關鍵檢測項目

2.1 酸度

2.1.1 分類

可以採用化學滴定法和液相色譜法測定。化學滴定法測定的是游離酸，結果以乳酸計（游離酸中乳酸佔主導）；液相色譜法測定的是游離酸與有機酸鹽，結果是以游離酸含量計。

如果液相色譜法存在分離度低的情況時，可以用生物傳感分析儀等其他方法對乳酸和乙酸進行測定。

2.1.2 化學滴定法

（1）樣品處理：取有代表性樣品至少200g，放入粉碎機粉碎，使其能完全通過40 目篩孔，充分混合。稱取1~2g 試樣，精確至0.0001g，置於100mL 燒杯中，加入100mL 無二氧化碳水，加入轉子，在磁力攪拌器上攪拌10min，使試樣中的有機酸全部溶解於溶液中。

（2）測定過程

方法一：待測定溶液中加入0.2mL1%的酚酞指示劑，用0.1mol/L 氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至微紅色30s不褪色。記錄消耗的標準溶液的體積。

方法二：用pH 值指示終點， 0.1mol/L 氫氧化鈉標準滴定溶液滴定控制pH 在8.0~10.0 之間。記錄消耗的標準溶液的體積。

（3）結果處理

根據酸鹼中和原理和化學反應的計量關係，計算氫離子含量，結果以乳酸計。計算結果表示到小數點後兩位。同一樣品兩次測定結果之差，不得超過兩次測定平均值的2%。

2.1.3 液相色譜法

有機酸的測定方法有離子色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜法等；HPLC 法具有方法簡單，分析速度快，靈敏度高的特點。

因飼料原料與發酵產物成分的複雜性，導致組分分離度低，造成測定結果偏高的現象。此時可以用兩種色譜柱分別進行檢測，進行對比。一種方法是用C18 柱（GB/T 5009.157 食品中有機酸的測定），還可以採用有機酸氫柱進行分析，參數如下：

色譜柱：Aminex HPX-87H, 300 mm×7.8 mm;

保護柱: Micro-Guard Cation H cartridge，30×4.6mm；

流動相: 0.005 mol/LH2SO4;

溫 度: 65 ℃;

流 速：0.6 mL/min;

進樣量: 15μL;

檢測器: 示差折光檢測器;

分析時間: 30 min。

2.1.4 生物傳感分析儀法

SBA-40D 型生物傳感分析儀利用酶促反應來進行定量分析，測定的關鍵傳感器是固定化酶和H2O2電極複合傳感器。

樣品經稀釋到合適的濃度範圍，用進樣針從進樣口注入反應池內，由反應池攪拌系統混勻。混勻的樣品透過固定化酶傳感器的支撐膜，在酶的催化下發生上式所示的生化反應，產生H2O2。因為反應池恆體積，每次進樣量也固定，所以反應池內樣品濃度與進樣樣品濃度是固定的比例關係。酶反應放出的H2O2透過酶膜的內層在鉑金電極表面失去電子還原成H2O，鉑電極獲得電子產生電流信號，該電流信號與H2O2的濃度成比例，而H2O2濃度與底物濃度成線性比例關係。通過比較被測物和標準樣品產生的H2O2量，就可計算出被測樣品中底物的含量。分析過程基於以下生化反應（表1）：

2.2 益生菌

枯草芽孢桿菌和乳酸菌、酵母菌有區別，它在發酵飼料中存在營養體與芽孢體。如果測定樣品中芽孢體可全部參照國家標準的樣品處理方法，如果測定樣品中的總數，則不能將樣品80 ℃水溶處理，因為營養體在此條件下能被滅活。

單一微生物的計數方法均可參照國家標準，但對於添加多種微生物的發酵飼料，由於微生物之間的相互作用，造成平板上菌落類型多、計數低的情況，進而對質量無法進行準確判斷。因此根據微生物特性，對樣品迚行預處理和選擇合適的培養基，能準確檢測益生菌數量。

發酵飼料中枯草芽孢桿菌用水稀釋後在NA 平板上塗布，嗜酸乳桿菌用50mg/L 納他黴素溶液稀釋後在MRS 平板上塗布，產朊假絲酵母菌用水稀釋後在孟加拉紅平板上塗布(圖1-3)。

2.3 蛋白質

2.3.1 分類

含氮物質，分為無機氮和有機氮。有機氮可分為水溶性有機氮和水不可溶性有機氮，也可分為酸溶性有機氮和酸不溶性有機氮。在飼料發酵過程中，關注的指標是無機氮、水溶性有機氮、酸溶性有機氮、游離胺基酸、總胺基酸。

2.3.2 無機氮

無機氮是非蛋白氮，其含量的高低影響飼料中粗蛋白的含量。樣品不需要消解，可直接測定或用水或酸溶解後測定清液。

2.3.3 有機氮

水溶性有機氮：精確稱取一定量的樣品（40 目通過率100%），用水溶解，混勻作靜置5 min，過濾，去除初濾液，濾液作為待測液。樣品消解後測定總氮，減去水溶性無機氮。

酸溶性有機氮：精確稱取一定量的樣品（40 目通過率100%），用15%的三氯乙酸溶液溶解，混勻幵靜置5 min，過濾，去除初濾液，濾液作為待測液。樣品消解後測定總氮，減去酸溶性無機氮。

2.3.4 胺基酸

游離胺基酸：精確稱取一定量的樣品（40 目通過率100%），用pH=2.2 的檸檬酸鈉緩衝溶液溶解混勻幵靜置5 min，過濾，去除初濾液，濾液作為待測液用胺基酸分析儀進行測定。

總胺基酸：不同的胺基酸採用不同的消解方法。酸水解測定賴氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、穀氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸。鹼水解測定色氨酸。氧化水解測定蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸。

2.3.5 肽

肽=酸溶蛋白-游離胺基酸。

2.4 碳水化合物

同蛋白質，存在還原糖、可溶性總糖、澱粉之分。最主要是根據試驗或生產需要選擇測定合適的檢測項目。在發酵飼料生產過程中，微生物需要利用可溶性還原糖或可溶性多糖通過酶解作用轉化的可溶性還原糖；因此在制定發酵飼料配方時，需要考慮提供的糖能否滿足微生物的生長代謝需求，進而才能得到需要的代謝產物。而在最終的發酵飼料產品中，因涉及到發酵飼料如何在日糧中添加的問題，比較關注對飼料中最終存在的還原糖、澱粉等。

3 結 論

發酵飼料的檢測項目，首先是衛生指標，必須符合國家標準；其次是理化指標，需根據生產廠家的質量目標而定；這兩類項目需要在企業標準中明確標註。最後是宣傳指標，可對有益營養成分或產品的亮點指標如胺基酸、酶活力、有機酸等進行介紹，可附有第三方檢測機構出具的檢測報告作為證明。

發酵飼料的檢測方法，主要依據相關的國家標準、行業標準，但並不是全部參照方法，需要結合樣品的實際特性和需求進行選擇。

註：本文由生物飼料開發國家工程研究中心(BFC)小編整理髮布。參考文獻略。責編：穆圖；審稿：劉晶晶博士；來源：當代化工;作者：陳影，盧宗梅、張琳、徐曉然、王梅、佟毅；

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