pH值對米糠清蛋白和球蛋白的結構、溶解性及表面疏水性的影響

　　米糠是稻米加工的副產品，其營養物質豐富，是我國一種量大面廣的可再生資源。米糠蛋白生物效價高，其中必需胺基酸的組成平衡合理，接近FAO/WHO推薦模式，是公認的優質植物蛋白質。米糠蛋白組分複雜，溶解性較差，所以其加工性能差，米糠分離蛋白的提取率低、產品的功能性質不佳，極大地限制了米糠蛋白的工業化生產，因此米糠蛋白質的提取和改性工作成為研究的重點。

　　鹼溶法是提取米糠蛋白的適合方法，說明pH值對米糠蛋白的提取影響較大。pH值的改變不僅會影響蛋白質的帶電性質，改變蛋白質功能基團的電離作用，還會影響蛋白質之間的相互作用，從而影響蛋白質的溶解性及其他功能性質。因此了解米糠蛋白質的功能性質以及結構隨pH值變化的規律，有利於米糠蛋白的提取，以及在生產過程中對食品感官特性的保護和營養價值的保留。

　　

　　米糠蛋白可分為清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白，其中清蛋白和球蛋白的含量所佔比重達73%，因此國家雜糧工程技術研究中心的楊健、王長遠*和黑龍江八一農墾大學食品學院的富天昕等人將其作為本研究的2 個目標蛋白。研究pH值對米糠清蛋白和球蛋白結構、溶解性及表面疏水性影響，有利於了解米糠蛋白亞基組分和空間構象與其加工處理條件的關係，對解決米糠蛋白提取率不高、加工性能不佳等問題具有指導意義，也為今後開發米糠蛋白產品的高效提取分離及加工提供理論依據。

　　1 米糠成分的測定

　　結果顯示，新鮮米糠中脂肪質量分數為26.7%，經正己烷脫脂後米糠的脂肪質量分數為3.92%，脫脂率為85.31%。脫脂後蛋白質質量分數高達15.76%，高於精白米本身的蛋白質質量分數（6%～10%），可見脫脂米糠是大米加工的副產品，是良好的植物蛋白資源。

　　2 米糠清蛋白、球蛋白的檢測

　　Lowry法測定提取液中蛋白質含量結果表明，在脫脂米糠中球蛋白提取率為30.5%，清蛋白提取率為34.6%；球蛋白的蛋白質純度為78.2%，清蛋白的蛋白質純度為65.7%。

　　3 米糠清蛋白、球蛋白的SDS-PAGE分析

　　

　　由圖1可以看出，米糠清蛋白主要亞基的分子質量分布於32、31、22、17、14 kDa，以及部分大於35 kDa的亞基歸屬譜帶；米糠球蛋白主要亞基的分子質量分布於63、53、49、36、21 kDa。可見清蛋白和球蛋白均以中小分子質量的亞基為主。

　　4 pH值對米糠清蛋白及球蛋白溶解性的影響

　　

　　如圖2所示，隨著pH值的增加，米糠清蛋白及球蛋白溶解性總體均呈現先下降後上升的趨勢。當pH值為4時，清蛋白的溶解度最低，當pH值在4～5左右時，球蛋白的溶解度最低，此時2 種米糠蛋白均接近自身的等電點，從而使得溶解度變差。但可發現，米糠清蛋白在等電點附近的溶解性要顯著高於米糠球蛋白的溶解性。這種溶解度的變化反映了酸鹼處理對蛋白質二、三級構象的改變作用。有研究指出，米糠蛋白溶解性較差的原因在於米糠蛋白結合了植酸、纖維素和其他成分，而鹼性環境對植酸、纖維素等組分的部分降解作用可弱化其對米糠蛋白結合作用，增強米糠球蛋白及清蛋白的溶解性。由於pH＜6時，米糠清蛋白及球蛋白的溶解性都較差，因此在接下來的研究中，選取pH 7～11條件下溶解性相對較好的樣品作為研究對象。

　　5 pH值對米糠球蛋白及清蛋白表面疏水性的影響

　　結果顯示，米糠清蛋白與球蛋白的表面疏水值均隨著pH值的增大呈上升趨勢，且清蛋白表面疏水值要顯著大於球蛋白的表面疏水值。在pH值為7～7.25之間時，米糠球蛋白的表面疏水值略大於清蛋白，隨著pH值的增大，米糠清蛋白的表面疏水性逐漸大於米糠球蛋白。由此推測，米糠清蛋白在鹼性條件下隨著pH值增加而呈現的表面疏水性增大主要與清蛋白亞基解離有關。另外，鹼性處理可以導致植酸的解離，使得蛋白分子結構更易展開，增加疏水性。

　　6 pH值對米糠清蛋白及球蛋白粒徑分布的影響

　　

　　由圖4可知，米糠清蛋白的表觀流體力學直徑分布平均值為134.3 nm，米糠球蛋白表觀流體力學直徑分布平均值為484.7 nm，並整體呈單粒徑峰分布。隨著pH值的增加，米糠清蛋白和球蛋白的流體動力學直徑分布均呈降低趨勢，米糠清蛋白的主峰逐漸解離呈2 個並肩粒徑峰，而球蛋白的主粒徑峰逐漸減小，並同步形成了一個20～70 nm的粒徑分布峰。這主要是由於鹼性環境下米糠球蛋白及清蛋白均發生了亞基解離，並明顯表現為大粒徑聚集體粒子降解形成更多的小粒徑粒子，故而隨著pH值的增加米糠清蛋白及球蛋白呈降低的變化趨勢。清蛋白5 000 nm的粒徑峰向低粒徑方向移動，而球蛋白在此位置的粒徑峰並未發生明顯變化。由此可以推測，米糠清蛋白歸屬於可溶性聚集體的大粒徑峰部分解離為小粒徑亞基，而球蛋白的可溶性聚集體解離現象並不顯著。推測鹼性條件下米糠清蛋白及球蛋白亞基解離是溶解性提高的原因之一。

　　7 pH值對米糠清蛋白及球蛋白Zeta電位的影響

　　結果顯示，隨著pH值的增大，米糠球蛋白及清蛋白Zeta電位絕對值均呈增大的變化趨勢。這是由於Zeta電位絕對值越大，表面所帶的負電荷越多，更多的同性電荷間的相互排斥會使蛋白質溶液更穩定，蛋白的聚沉減少，蛋白質溶解度變大，因此米糠蛋白Zeta電位絕對值的增大是米糠蛋白溶解性增加的原因之一。

　　8 pH值對米糠球蛋白及清蛋白結構影響的CD分析

　　結果顯示，米糠清蛋白隨著pH值升高，α-螺旋含量呈逐漸增大，β-摺疊則逐漸降低，無規捲曲含量逐漸增大，而米糠球蛋白隨著pH值的升高，其主要的二級結構單元含量未發生顯著變化。球蛋白中多數二級結構為無規捲曲和分子內的大量反β-摺疊，而清蛋白多為α-螺旋和分子內有序的β-摺疊。可見米糠蛋白的二級結構與很多植物蛋白相似，即含有較少的α-螺旋，大量的β-摺疊和無規捲曲。

　　9 pH值對米糠球蛋白及清蛋白結構影響的拉曼光譜分析

　　

　　如圖6所示，隨著pH值增大，米糠球蛋白α-螺旋及β-轉角含量均未變化，但卻發生由β-摺疊向無規捲曲的部分轉變。由此可知米糠球蛋白在實驗條件下二級結構較為穩定，而清蛋白二級結構單元發生了由β-摺疊向α-螺旋與無規捲曲的轉變。米糠清蛋白在拉曼光譜分析中儘管各結構單元組分含量與CD的結果有所出入，但變化規律均相似。

　　10 pH值對主鏈結構影響的分析

　　米糠蛋白的二級結構組成主要由醯胺I帶確定，醯胺I帶拉曼特徵峰位置為：α-螺旋1 645～1 660 cm-1；β-摺疊1 665～1 680 cm-1；β-轉角1 680～1 690 cm-1；無規捲曲1 660～1 670 cm-1。由基於拉曼光譜醯胺I帶擬合分析得出的米糠球蛋白及清蛋白二級結構結果可以看出，在所測範圍內，隨著pH值的增大，米糠球蛋白α-螺旋及β-轉角含量均無顯著變化（P＞0.05），而β-摺疊含量降低趨勢，無規捲曲含量呈增大趨勢。與CD的結果相比有所差異，這種構象的轉變可能與鹼性條件下亞基解離有關。

　　11 pH值對側鏈結構影響的分析

　　結果顯示，米糠清蛋白中的極性中性胺基酸相對含量最低（15.1%），其他類型的胺基酸含量適中；米糠球蛋白含有較高的鹼性胺基酸（22.0%），非極性胺基酸相對含量最少（40.0%）。

　　結果顯示，在所測pH值條件下米糠球蛋白及清蛋白的酪氨酸殘基趨向於「暴露式」，結合對殘基暴露與包埋分子數看出，酪氨酸殘基較多暴露於分子的表面，並作為氫鍵的供體或受體與水相互作用。隨著pH值的增大，米糠清蛋白及球蛋白的酪氨酸費米共振線I850/I830及殘基暴露與包埋分子數的比值均未發生顯著變化（P＞0.05）。

　　760 cm-1附近的拉曼譜帶歸屬為色氨酸側鏈，隨著pH值的增大，米糠清蛋白和球蛋白色氨酸側鏈歸屬譜帶強度均呈下降趨勢。還有研究表明蛋白質變性造成的結構解摺疊常會引起色氨酸殘基的暴露，在拉曼譜圖中表現為色氨酸譜帶強度的降低。結果表明，隨著pH值的增大，米糠清蛋白及球蛋白結構趨於「暴露」態。說明米糠清蛋白及球蛋白隨著pH值的增高亞基解離相伴形成的分子結構解摺疊以及鹼性pH值對穩定米糠蛋白內部結構作用力的弱化作用使得在鹼性pH值誘導下色氨酸殘基更趨於「暴露」態。

　　結 論

　　本研究通過蛋白質化學理論和譜學分析技術手段探究了pH值對米糠清蛋白及球蛋白結構、溶解性及表面疏水性的影響。隨著pH值的增大，米糠清蛋白、球蛋白的流體動力學直徑分布均呈降低趨勢，米糠清蛋白歸屬於可溶性聚集體的大粒徑峰部分解離為小粒徑亞基，而球蛋白的可溶性聚集體解離現象不顯著；米糠球蛋白、清蛋白Zeta電位絕對值均呈增大的趨勢。進一步得出，pH值的改變影響著米糠清蛋白中α-螺旋、β-摺疊以及無規捲曲結構的含量；米糠清蛋白及球蛋白的色氨酸殘基趨近於「暴露」態。最終在鹼性條件下，米糠球蛋白保留了大部分二級結構、亞基解離誘導的蛋白質三級結構解摺疊小幅提高了其表面疏水性；而米糠清蛋白的二級結構單元的無序性轉變、亞基解離誘導的蛋白結構解摺疊卻增大了其表面疏水性；亞基解離成小粒徑以及鹼性條件賦予米糠蛋白電荷增加了米糠清蛋白及球蛋白的溶解性。

　　本文《pH值對米糠清蛋白和球蛋白的結構、溶解性及表面疏水性的影響》來源於《食品科學》2020年41卷18期51-57頁，作者：楊健，富天昕，張舒，馮玉超，王長遠。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190716-222。

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