這次由實驗室小張帶大家了解一波CCK-8。
概述：Cell Counting Kit- -8 (CCK- -8) 利用了Dojindo開發的水溶性四唑鹽- -wsT@-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯) -2H-四唑單鈉鹽)，它在電子載體1-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲臢染料，如圖1所示。CCK- 8溶液可以直接加入到細胞樣品中;不需要預配各種成分。CCK- -8法是用於測定細胞增殖或毒性實驗中活細胞數目的一種高靈敏度，無放射性的比色檢測法。WsT@ -8被細胞內脫氫酶氧化還原後生成的橙黃色甲臢染料能夠溶解在組織培養基中(如圖2所示),生成的甲臢量與活細胞數量成正比。
操作步驟：
製作標準曲線：
1.先用細胞計數板計數所製備的細胞懸液中的細胞數量，然後接種細胞。
2.按比例(例如: 1/2比例) 依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3- -5個細胞濃度梯度，每組3- 6個復孔。
3.接種後培養2- -4小時使細胞貼壁，然後加CCK-8試劑培養-定時間後測定O.D值，製作出一條以細胞數量為橫坐標(X軸)，O.D值為縱坐標(Y軸)的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量(使用此標準曲線的前提條件是實驗的條件要一致，便於確定細胞的接種數量以及加入CCK--8後的培養時間)。
細胞活性檢測：
1.在96孔板中接種細胞懸液(100 μl /孔)。將培養板放在培養箱預培養(在37C, 5% CO2的條件下)。
2.向每孔加入10 μ的CCK- 8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響O.D值的讀數)。
3.將培養板在培養箱內孵育1- 4小時。
4.用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。
細胞增殖-毒性檢測：
1.在96孔板中配製100 μ的細胞懸液。將培養板在培養箱預培養24小時(在37C, 5% CO2的條件下)。
2.向培養板加入10 uI不同濃度的待測物質。
3.將培養板在培養箱孵育一段適當的時間(例如: 6,12, 24或48小時)。
4.向每孔加入10 ul CCK--8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響O.D值的讀數)。
5.將培養板在培養箱內孵育1- 4小時。
6.用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。
★如果暫時不測定O.D值，打算以後測定，可以向每孔中加入10 ul Stop Solution,井遮蓋培養板避光保存在0—5C條件下，在7天內吸光度不會發生變化。
計算公式:
細胞存活率= [(As-Ab) / (Ac-Ab)]x 100%
抑制率= [(Ac- As) 1 (Ac _Ab)] x 100%
As:實驗孔(含有細胞的培養基、CCK-8、 待測物質)
Ac:對照孔(含有細胞的培養基、CCK-B、沒有待測物質)
Ab:空白孔(不含細胞和待測物質的培養基、CCK-8)