細胞是生物體基本的結構和功能單位。近年來，單細胞的研究格外火熱，多篇 Nature、Cell 的高分文章都是通過單細胞水平研究獲得的。尤其在腫瘤領域，單細胞研究可以很好的避免腫瘤異質性的幹擾。下文以順鉑化療的耐藥機制為例，呈現了單細胞研究的多種方法。拉到文末可免費領取實驗方案資料。
順鉑耐藥的分子機制
順鉑（Cisplatin）是 1978 年經 FDA 批准用於臨床治療癌症的化療藥物。順鉑藥物的治療機制是通過形成 Pt-DNA 複合物，幹擾 DNA 複製合成，從而殺死癌細胞，屬於細胞周期非特異性藥物。許多癌症患者在用藥初期對鉑類的治療比較敏感，但一段時間後，患者通常對順鉑治療表現出耐藥性，導致癌症復發。
因此在化療後細胞必須修復 DNA 損傷，否則 DNA 複製受阻會導致細胞死亡。對於順鉑的耐藥機制研究，也是目前抗癌藥物研究熱點。主流的三個研究方向分別是 DNA 修復加速、胞漿失活加速和細胞攝取藥物能力的變化。其中，細胞攝取藥物能力的變化主要表現在細胞對順鉑的攝入能力降低及轉運加速。
細胞內順鉑的攝入與腫瘤負荷相關，也就是說腫瘤對順鉑反應降低會導致細胞內順鉑的含量降低。所以，分析單個細胞水平對順鉑的攝入和分布對於評估治療的有效性具有非常重要的意義。過多順鉑進入細胞內會增加 DNA 損傷和細胞死亡的頻率。了解單個細胞水平及細胞亞群對順鉑的攝入的機制將能為新療法的開發提供科學依據，以改善腫瘤對順鉑的耐藥性，降低腫瘤復發率。
單細胞 ICP-MS NexIon2000
單細胞電感耦合等離子體質譜（SC-ICP-MS）是以單顆粒電感耦合等離子體質譜技術為基礎，測量單個細胞（或單個納米顆粒）在進入等離子體時產生的離散信號，實現對溶液中的金屬元素進行評估與定量。每個細胞中的金屬成分離子化，產生離子流，檢測器以每秒 100 000 數據點的速度快速對信號採集測量，從而使得單個細胞中的金屬含量能被定量到阿克（ag）/ 每細胞的水平。相比測量細胞內順鉑攝入的傳統方法，SC-ICP-MS 所得結果的信息量更加全面。
通過對兩株卵巢癌細胞系 A2780（順鉑敏感型）和 A2780/CP70（順鉑耐藥型）順鉑攝入量的實時檢測發現：相比 A2780 敏感細胞系，順鉑攝入在耐藥性的 A2780/CP70 細胞系上水平降低；但順鉑攝入的細胞差異不是由於細胞周期的不同，因為血清飢餓細胞並不改變順鉑的整體攝入。順鉑攝入的胞內差異性是由於其他尚未確定的因素造成的。
「三陰性」乳腺癌（Triple-Negative Breast Cancers, TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體（HER2）均陰性的一種特殊類型乳腺癌。「三陰性」乳腺癌約佔所有乳腺癌的 10-20%， 但因其缺乏內分泌及抗 HER2 治療的靶點，目前治療尚以傳統外科切除、化療及放療為主。鉑類藥物化療是當前針對晚期乳腺癌的標準治療方案。[2] 順鉑類藥物已被報導通過解偶聯 DNA 複製周期和中心粒複製調控造成中心粒擴增，從而抑制腫瘤細胞增殖。[3]
2018 年，Nirmech Patel 等人在 Nature communication 雜誌上發表了相關研究。他們結合整合基因組學、RNAi 技術和功能型驗證，對乳腺癌和非惡性細胞上的 130 多個潛在基因研究發現，有 13 個基因簇通過影響細胞周期檢驗點、DNA 損傷應答和惡性細胞選擇性分裂上調「三陰性」乳腺癌發病傾向。其中 KIFC1 驅動蛋白作為高選擇性的惡性細胞靶標，通過順鉑化療與 KIFC1 聯合協同效果的研究結果進一部表明，KIFC1 最有潛力成為新型藥物靶點。[4]
在研究順鉑化療藥物與 KIFC1 協同治療實驗設計中，兩個關鍵的單細胞水平研究方法：中心粒擴增打分和多極性有絲分裂實驗，都是使用 Operetta 高內涵成像系統進行共聚焦高解析度圖像採集後，再通過 Hamony 軟體對中心粒擴增和多極性有絲分裂進行自動數據分析及數據挖掘。
高內涵成像系統 Operetta CLS
• 中心粒擴增打分實驗設計
為在乳腺癌細胞模型上確認 KSFC1 與中心粒擴增的相關性，11 種乳腺癌相關的細胞株用於中心粒擴增打分實驗。免疫螢光方法標記中心粒組裝關鍵蛋白激酶 Aurora A（綠色）和中心粒標記物 CP110（紅色），Hoechst 標記細胞核（藍色），通過 Operetta 高內涵成像獲取高解析度圖像，如下圖 b 中所示，Low CA 組中心粒數量、螢光強度和面積都遠低於 High CA 組，後續通過 Hamony 軟體對中心粒擴增進行分析打分，發現針對 KIFC1 基因的#2/#4/#5/#6 四組 SiRNA 能有效增加 KIFC1 依賴的中心粒擴增。
• 多極性有絲分裂實驗設計
免疫螢光標記 Aurora A（綠色）和雙極有絲分裂驅動蛋白 Eg5（紅色），Hoechst 標記細胞核（藍色），通過 Operetta 高內涵成像獲取高解析度圖像及 Hamony 軟體進行多極性有絲分裂分析打分，發現在 3 株中心粒高擴增的細胞系和 4 株中心粒低擴增細胞系中，KIFC1 沉默都能顯著提高單個細胞的紡錘體數量，造成有絲分裂多極性（下圖 a-b）。並且通過在 MDA-MB-231 細胞株上的實時動態檢測進一步驗證了 KIFC1 沉默對有絲分裂多極性的影響（下圖 c）。
圖片來源：Nature Communicatio
後續通過進一步實驗研究驗證，順鉑藥物能提高中心粒擴增，且能在 KIFC1 沉默的情況下，提高順鉑藥物對中心粒擴增的敏感性。這就意味著 KIFC1 蛋白可以作為順鉑化療藥物聯合治療的潛在藥物靶點，用於針對三陰性乳腺癌患者的精準治療方案。
參考文獻
1. 最新研究進展——利用單細胞電感耦合等離子體質譜評估卵巢癌細胞對順鉑的攝入
2. Untch, M. et al. ABC3 consensus commented from the perspective of the German guidelines: Third International Consensus Conference for Advanced Breast Cancer (ABC3), Lisbon, 07. 11. 2015. Geburtshilfe Frauenheilkd. (2016) 76,156–163.
3. Zou, J. et al. FancJ regulates interstrand crosslinker induced centrosome amplification through the activation of polo-like kinase 1. Biol. Open (2013) 2,1022–1031.
4. Nirmesh Patel et al. Integrated genomics and functional validation identifies malignant cell specific dependencies in triple negative breast cancer. Nature Communication (2018) 9:1044.
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題圖來源：shutterstock 正版圖庫
圖片來源：珀金埃爾默
文章來源：珀金埃爾默