張志斌/劉志博/邵峰等揭示細胞焦亡在腫瘤免疫方面的全新功能

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細胞焦亡（Pyroptosis）是最近受到廣泛關注的一種程序性細胞壞死 （Programmed Necrotic Cell Death）。與免疫沉默的細胞凋亡（Apoptosis）不同，細胞焦亡以細胞膜破裂為特徵，諸多細胞因子和危險信號分子在細胞焦亡中被釋放，激活免疫系統，導致炎症反應。膜穿孔蛋白Gasdermin D（GSDMD）做為細胞焦亡的執行者，能夠被半胱天冬蛋白水解酶Caspase-1/4/5/11切割【1,2】，切割產生的GSDMD N端片段多聚化，並在細胞膜上穿孔，從而導致細胞焦亡的發生【3,4】。GSDMD介導的細胞焦亡是拮抗病原感染的重要先天免疫反應，但過量則能夠導致包括敗血症在內的多種疾病。人類Gasdermin 家族一共有六個成員，包括GSDM A-D, GSDME（又名DFNA5）以及DFNB59。研究表明GSDM A-E 都具有膜穿孔（Pore-forming）活性，能夠在細胞中誘導細胞焦亡【4】。但除了GSDMD，其它的GSDM 蛋白如何被激活，以及它們的生物學功能都不清楚。最近的研究表明GSDME 能夠被Caspase-3 切割激活，從而導致細胞凋亡到細胞焦亡的轉換【5,6】。然而GSDME 的生物學功能以及體內激活它的上遊通路都有待進一步的研究。

2020年3月11日，哈佛醫學院及波士頓兒童醫院Judy Lieberman研究組在Nature雜誌在線發表題為「 Gasdermin E suppresses tumor growth by activating anti-tumor immunity」的論文，報導了來自殺傷細胞（Killer Cells）的顆粒酶Granzyme B（GzmB）能夠直接切割GSDME，激活癌細胞細胞焦亡，而細胞焦亡的發生進一步激活抗腫瘤的免疫反應，抑制腫瘤生長。本研究中，哈佛醫學院講師張志斌博士與張瑩博士為本文的共同第一作者，張志斌博士和美國藝術與科學院院士Judy Lieberman博士為本文的共同通訊作者。該研究組曾於2016年在Nature發文報導GSDMD的膜穿孔活性，揭示細胞焦亡的分子機制【3】。

之前的研究表明GSDME的啟動子在多種癌症細胞中被甲基化，這一表觀修飾抑制了GSDME在癌細胞中的表達【7】。這一觀察讓作者推測GSDME可能抑制腫瘤生長。在本研究中，作者首先分析並檢測了TCGA（The Cancer Genome Atlas）資料庫癌症病人樣品中GSDME 的基因突變。在檢測的22個突變中，大部份突變降低了GSDME誘導的細胞焦亡，進一步暗示GSDME可能參與腫瘤抑制。之後作者通過四種小鼠腫瘤模型，直接證明了癌細胞內GSDME的表達能夠顯著抑制小鼠體內腫瘤的生長。同時，與對照組相比，GSDME表達的腫瘤內有更多的自然殺傷細胞（Natural Killer Cells）以及CD8陽性殺傷T細胞（CD8 Cytotoxic T Killer Cells），並且這些負責清除腫瘤細胞的殺傷細胞比對照組表達更多的毒性蛋白和細胞因子，更為活躍。

作者進一步發現在免疫缺陷小鼠以及自然殺傷細胞和CD8陽性殺傷T細胞缺失的小鼠中，GSDME對腫瘤的抑制作用消失了，表明這一抑制作用依賴於免疫系統中的這兩種殺傷細胞。殺傷細胞內存在大量的毒性顆粒（Cytotoxic Granules），內含大量的穿孔蛋白Perforin以及顆粒酶Granzymes。在識別癌細胞後，殺傷細胞能夠釋放體內的毒性顆粒內容物。在穿孔蛋白Perforin的幫助下，顆粒酶被運送到癌細胞中，切割一系列底物（包括Caspase-3），從而引起細胞凋亡。穿孔蛋白Perforin的缺失則能夠完全抑制殺傷細胞通過顆粒酶誘導的細胞凋亡。作者發現在Perforin缺失的小鼠中，GSDME對腫瘤的抑制作用同樣消失了，進一步證明GSDME的腫瘤抑制效應是由殺傷細胞介導。通過小鼠接種實驗（Vaccination），作者證明GSDME腫瘤細胞中有細胞焦亡發生，並且細胞焦亡是一種免疫性細胞死亡（Immunogenic Cell Death）。

固有觀點認為殺傷細胞通過細胞凋亡清除癌細胞或感染細胞，但在本研究中，通過殺傷細胞與目標癌細胞的共孵育，作者證明了殺傷細胞能夠在高表達GSDME的癌細胞內誘導細胞焦亡，並且細胞焦亡的發生依賴於毒性顆粒內容物的釋放。然而Caspase抑制劑以及Caspase-3抑制劑都只能部分抑制殺傷細胞誘導的細胞焦亡，暗示存在不依賴於Caspase-3的GSDME 激活通路。

GzmB是殺傷細胞毒性顆粒中豐度最高的顆粒酶，它的底物包括Caspase-3。在含有GSDME的細胞裂解液中，作者發現重組GzmB蛋白能夠特異誘導GSDME 的切割，並且在Caspase 抑制劑存在或者在Caspase-3缺失的情況下，這一切割只是被部分抑制。但突變掉Caspase-3切割位點（270位的天冬氨酸），則切割被完全抑制。進一步研究表明重組GzmB能夠直接切割重組GSDME蛋白, 且其切割位點與Caspase-3切割位點一致。通過在GSDME細胞以及GSDME缺失細胞中加入Perforin 和GzmB, 作者進一步在細胞中驗證了GzmB對GSDME 的切割以及由此誘導的依賴於GSDME 的細胞焦亡。

最後，在小鼠腫瘤模型中，作者分別用正常的GSDME，膜穿孔活性缺失的GSDME（F2A）, 以及切割位點突變的GSDME（D270A）進行了互補實驗。結果表明只有正常的GSDME 能抑制腫瘤生長，而其它突變GSDME都與對照組無顯著差異，表明GSDME的腫瘤抑制及免疫激活功能依賴於GzmB/Caspase-3誘導的GSDME細胞焦亡。

總而言之，該研究揭示了GSDME的全新生理功能及其內源激活機制，闡明了細胞焦亡在腫瘤免疫中的重要作用，為腫瘤治療提供了新的思路。

在同期Nature雜誌上，來自北京大學應用化學系的劉志博課題組和來自北京生命科學研究所邵峰課題組合作發表了題為「A bioorthogonal system reveals antitumour immune function of pyroptosis」的研究論文，通過新型生物正交體系同樣揭示了細胞焦亡的抗腫瘤免疫功能。

這篇文章的研究思路與前一篇不同，該工作前期主要基於劉志博實驗室開發的生物正交體系。劉志博實驗室前期的工作發現一類含硼胺基酸探針（18F-硼氨酸）在腫瘤上有顯著且特異的攝取，並將其用於臨床中腦瘤的早期診斷和精確劃界限。在最新的這項研究中，研究人員在細胞以及活體水平上構建了苯丙硼氨酸（Phe-BF3）介導的生物正交剪切系統，賦予硼氨酸探針激活功能，並通過「雙靶向激活」策略實現了腫瘤選擇性的蛋白功能調控。

由於邵峰實驗室前期發現的Gasdermin蛋白在介導細胞焦亡過程中發揮關鍵的調控作用，Gasdermin蛋白被激活後在細胞膜上打孔導致細胞發生焦亡，誘導了強烈的炎症反應。研究人員運用前述的生物正交剪切系統，揭示少部分的腫瘤細胞發生焦亡，就足以有效調節腫瘤免疫微環境，進而激活很強的T細胞介導的抗腫瘤免疫反應，該發現為腫瘤免疫治療藥物研發提供了新的思路，Gasdermin家族蛋白也成為潛在的腫瘤免疫治療的生物標誌物，這類蛋白的激動劑則很有可能成為抗腫瘤藥物研發的新方向。

從另一個角度來講，基於三氟化硼脫矽反應的「雙靶向激活」策略效率高、生物正交性好的優勢，揭示了將探針改造為激活劑這一設想在活體蛋白激活上的巨大潛力。

據悉，劉志博實驗室的博士生王欽陽和邵峰實驗室的博士後王玉鵬是本文的共同第一作者，劉志博博士和北京生命科學研究所邵峰博士是本文的共同通訊作者。

參考文獻

1.Shi, J.et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determinespyroptotic cell death.Nature526, 660-665,(2015).

2.Kayagaki,N.et al. Caspase-11 cleavesgasdermin D for non-canonical inflammasome signalling.Nature526,666-671,(2015).

3.Liu,X.et al. Inflammasome-activatedgasdermin D causes pyroptosis by forming membrane pores.Nature535,153-158,(2016).

4.Ding,J.et al. Pore-forming activity andstructural autoinhibition of the gasdermin family.Nature535,111-116,(2016).

5.Rogers,C. et al. Cleavage of DFNA5 bycaspase-3 during apoptosis mediates progression to secondarynecrotic/pyroptotic cell death.Nature communications8, 14128,(2017).

6.Wang,Y. et al. Chemotherapy drugs inducepyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin.Nature547,99-103,(2017).

7.deBeeck, K. O., Van Laer, L. & Van Camp, G. DFNA5, a gene involved in hearingloss and cancer: a review.The Annals ofotology, rhinology, and laryngology121,197-207,(2012).

來源：BioArt

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