2020-12-30 16:54 來源：澎湃新聞·澎湃號·政務
2020年12月28日，安徽省農業科學院水稻研究所魏鵬程團隊在Molecular Plant 在線發表了題為Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical protospacer-adjacent motif compatibility in plants 的研究論文。該研究在水稻中利用SpCas9變體NRRH、NRTH和NRCH（R為A/G, H為A/C/T），將SpCas9識別PAM序列擴展至NRNH， 利用SpCas9變體SpG，提供高效穩定的NG PAM識別能力，利用SpCas9變體SpRY，實現幾乎不受PAM限制的植物基因組靶向編輯。該研究開發了多種識別非典型PAM序列SpCas9變體植物靶向突變工具及單鹼基編輯工具，構建了多用途、簡單易用的植物廣適性基因編輯工具盒，顯著提高了CRISPR-SpCas9系統在植物中的編輯能力。
CRISPR/Cas系統作為強大的基因組編輯工具，已經在許多模式植物和農作物中成功應用。儘管有多種植物CRISPR-Cas編輯工具被報導，來源於鏈球菌SpCas9因其活性高效穩定，應用最為廣泛，也成為CRISPR衍生工具開發的主要平臺。但SpCas9僅能識別經典的「NGG」PAM序列，嚴重限制了基因組上可靶向範圍。因此研究人員一直在嘗試打破PAM限制。儘管通過改造SpCas9已獲得識別不用種類PAM的SpCas9變體， 例如：識別NGA PAM的Cas9-VQR變體、識別NGAG的Cas9-EQR變體、識別NGCG的Cas9-VRER變體、主要識別NG的xCas9和SpCas9-NG變體、以及識別NAA的SpCas9-SmacCas9人工雜交變體iSpyMacCas9等。但這些PAM擴展SpCas9工具編輯範圍仍相對有限，因此植物基因組編輯急需開發多樣化、效率穩定的SpCas9變體工具。
2020年2月，哈佛大學David R. Liu課題組報導了利用噬菌體輔助連續（非連續）進化技術開發出的三種SpCas9變體，其不受限於必須含G鹼基的要求，分別識別NRRH、NRCH和NRTH PAM序列。2020年3月，哈佛醫學院Benjamin P. Kleinstiver團隊報導了SpG的變體，能夠穩定識別NGN PAM， 進一步優化該酶，獲得了一種近PAMless SpCas9變體SpRY。SpRY核酸酶和鹼基編輯器變體可以靶向幾乎所有PAM。
該研究在水稻密碼子優化的SpCas9基礎上引入系列關鍵胺基酸突變，構建了植物SpCas9-NRRH、SpCas9-NRCH、SpCas9-NRTH、SpG和SpRY基因編輯系統（上圖），進而通過穩定轉化水稻，在愈傷群體中檢測比較了這些新型變體的靶向編輯活性。研究利用SpCas9-NRRH、SpCas9-NRCH和SpCas9-NRTH靶向了水稻基因組138個NRNH位點，amplicon-NGS表明這些變體在大部分位點都具有編輯效率，與SpCas9和SpCas9-NG的比較也說明NRRH類變體可編輯傳統SpCas9系統難以靶向的植物基因組位點；利用SpG變體及SpCas9-NG分別靶向水稻基因組32個NGN位點， 比較編輯效率表明SpG較SpCas9-NG在NGH 位點效率大部增強，可能更適於植物非典型NG位點的編輯；而利用SpRY也在水稻OsPDS基因上靶向了64個可能的NNN PAM， 在超過半數SpCas9不能識別非典型的PAM位點上， SpRY均能誘導有效突變（編輯效率>5%）。這些結果在再生水稻株系群體中得到了進一步驗證
在此基礎上，這些SpCas9變體分別與小鼠胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1、人胞嘧啶脫氨酶APOBEC3a及定向進化後的大腸桿菌腺嘌呤脫氨酶（TadA*-8e）融合，開發了相應的-eBE3，-eA3A和-ABE8e系列植物單鹼基編輯工具。所構建的工具盒在水稻基因組多個不同PAM位點實現了C·G::T·A鹼基間的定點替換，特別是ABE8e融合的腺嘌呤鹼基編輯工具在多底盤、多位點均表現穩定高效介導A-to-G替換， 顯示出優良的應用性。該研究在植物系統中有效擴展了SpCas9識別的PAM範圍，豐富了植物基因編輯系統類型，也為作物品種改良等提供了更廣泛、高效、精準的新工具。
該研究由安徽省農業科學院水稻研究所完成，李娟副研究員和許蓉芳副研究員為論文共同第一作者，魏鵬程研究員為論文通訊作者。相關工作得到了國家自然科學基金聯合創新基金、轉基因專項、安徽省自然科學基金等的資助。
論文連結：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674205220304482
來源：BioArtReport
1980-2020
原標題：《【學術前沿】魏鵬程團隊開發植物廣適性基因編輯工具盒，識別非典型PAM序列》
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