【課題套路】一篇NC教你組蛋白甲基化課題新套路

大家好，我是想課題思路想到裂開的無花果。

前幾天國自然基金委公布生命科學部會評專家名單，預計九月，醫學部的會評也將落下帷幕。

明年的基金申請即將開始，你準備好了嗎？是否已經選定課題方向？

現如今，表觀遺傳學在疾病研究中的地位越來越重要，高分論文中不乏DNA/RNA/蛋白的甲基化/乙醯化研究。我們公眾號已經陸續解讀過研究熱點m6A的課題設計思路（後續還會有關於m6A的各種技術帖噠），這一回讓我們來看看組蛋白甲基化修飾的研究應該如何設計。

這篇今年3月發表於Nature Communication，題為「Histone methyltransferase DOT1L cordinates AR and MYC stability in prostate cancer」的研究論文就重點關注了組蛋白甲基轉移酶DOT1L在前列腺癌中通過泛素連接酶調控雄激素受體AR和轉錄因子MYC的機制。

這篇文章乍一看是一個符合我們通常套路的研究，沒有什麼新意，然而仔細一讀，就會發現整個研究過程雖然每一步都在這條路上，但最終呈現的結果卻是一個比較新的調控機制。

首先，讓我們先按經典的思路來分析一下這篇文章。

立項依據：

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤，致死率僅次於肺癌。目前晚期前列腺癌的主要治療方法包括靶向雄激素受體AR的治療。儘管大部分的患者起初能夠響應治療，許多患者會發展為去勢抵抗的前列腺癌（CRPC），影響治療效果。其主要原因在於AR的持續信號轉導，新一代AR靶向藥物恩扎魯胺（ENZA）的耐藥性產生的原因之一就是AR通路的持續激活。

DOT1L是H3K79（組蛋白3第79位賴氨酸）甲基化酶，與轉錄激活、延伸、DNA修復等密切相關。以往研究發現DOT1L在急性髓系白血病的發病機制中起重要作用，以及在實體瘤中抑制DOT1L具有療效，然而，DOT1L對前列腺癌的作用尚不明確。

本研究通過探索DOT1L在前列腺癌中的作用機制，開發針對前列腺癌的新型治療靶點，具有潛在的臨床應用價值。

為了探索DOT1L促進前列腺癌耐藥性的分子機制，作者進行了以下預實驗：

1. 用前列腺癌資料庫和患者樣本分析DOT1L與前列腺癌預後的相關性

作者選取了4個前列腺癌數據集（Grasso，Yu，Gulzar，Taylor）分析DOT1L表達量，並用4個數據集（Luca CancerMap prostate cancer，TCGA prostate cancer，Ross-Adams Discovery，TCGA Gleason）分析DOT1L表達量與患者預後的關係，發現DOT1L高表達與前列腺癌較差的預後相關。對患者腫瘤組織樣本進行免疫組化檢測H3K79me2，證實前列腺癌組織H3K79me2甲基化程度高。

2. 對前列腺癌細胞系使用DOT1L抑制劑（EPZ）觀察細胞表型以及AR表達情況

克隆形成實驗和細胞活性檢測驗證DOT1L抑制劑能有效抑制前列腺癌細胞生長和活力，AR陽性CRPC細胞（C42B），AR過表達細胞（22Rv1）以及ENZA耐藥細胞對DOT1L抑制劑敏感。 

 

EPZ長時間處理後，AR轉錄水平不變，蛋白水平顯著降低。

ChIPseq、RT-qPCR檢測EPZ處理後AR下遊基因表達，發現部分下調，但部分顯著上調，與AR被抑制矛盾。（這就表明可能有另一個轉錄因子同時調控AR下遊基因）

 

3. GSEA分析、AR靶基因預測、抑制MYC差異基因分析確定DOTL1同時調控MYC與AR

為了尋找DOTL1靶向的通路，作者首先對EPZ處理的LNCaP和PC3細胞中的轉錄因子進行GSEA分析，發現MYC通路顯著變化，MYC靶基因在EPZ處理下被抑制。隨後將MYC抑制細胞/AR靶向的顯著差異基因進行比對，發現兩者重合率高。WB顯示僅EPZ處理的LNCaP細胞MYC表達量顯著降低。（這些表明MYC通過AR依賴的機制受到DOTL1調控） 

 

4. EPZ處理後差異基因表達分析和對候選基因表達量分析找到EPZ調控的E3泛素連接酶

作者推測EPZ介導的AR/MYC受到抑制是由於兩者蛋白穩定性下降造成，因此通過差異基因表達分析尋找候選的E3泛素連接酶。檢測EPZ處理的前列腺癌細胞中候選基因的表達量，並敲減候選基因，檢測AR和MYC蛋白水平，最終確定E3泛素連接酶HECTD4和MYCBP2。

 

5. AR激動劑（DHT）/抑制劑（ENZ）處理發現AR調控MYCBP2

為了進一步闡明調控機制，作者用AR的激動劑/抑制劑分別處理前列腺癌細胞並檢測候選泛素連接酶的表達量，發現MYCBP2顯著上調/下調。

 

於是最終確定的分子有：DOTL1、AR、MYC、HECTD4和MYCBP2。

基於以上結果，可以提出假說：組蛋白甲基轉移酶DOT1L通過泛素連接酶HECTD4、MYCBP2降低AR、MYC的蛋白穩定性，從而抑制AR、MYC下遊基因的轉錄。而MYCBP2又受到AR轉錄調控，形成反饋機制。差不多是這樣的：

接下來進行體內外實驗驗證這個機制，再用分子實驗驗證一下幾個蛋白之間的調控關係就完事兒了，一切看似是個包含老套路的新文章誕生。

你以為作者就會按照這個套路做下去？然而並沒有。

作者認為，這樣的機制沒有說服力，不能代表這一調控的真實過程。（可能作者也做了AR與MYCBP2的ChIP實驗，但結果是陰性）

因此，作者又檢測了MYC敲減細胞在AR抑制劑處理下HECTD4和MYCBP2的表達量，發現兩者無論是否有AR抑制劑表達量都顯著上升。（這就提示MYC可能直接負調控HECTD4和MYCBP2！）

 

按往常的思路，只要驗證MYC與HECTD4和MYCBP2的調控關係就能形成完美的反饋調節機制。

於是作者首先分析了一下臨床數據中DOTL1、MYC和HECTD4、MYCBP2表達的相關性，結果悲劇了……如下圖所示，MYC的表達量和HECTD4、MYCBP2並沒有很強的相關性。

難道這一切只是假象？趕緊來個ChIP-seq數據壓壓驚。分析一通，發現MYC確實結合HECTD4和MYCBP2的啟動子。RT-qPCR驗證，結果也一樣。

那麼問題來了，為什麼臨床數據和實驗結果不符？（反正是我我得抓狂）

作者想到了一個點：是不是和DOT1L只在腫瘤細胞中特異調控MYC這條通路有關？是否AR和DOT1L共調控MYC？（這一點都能想到反正我是服的）

於是作者開始了一系列驗證操作：

1. H3K79me2 ChIP-seq驗證僅LNCaP細胞中，MYC DNA的基因下遊Enhancer區（增強子）H3K79me2甲基化富集，EPZ處理後富集消失。在AR的ChIP-seq結果中也發現MYC的Enhancer區。

2. PDX（患者來源的異種移植瘤）模型的ChIP-qPCR顯示AR結合和H3K79me2位點。

3. 使用AR激動劑/抑制劑的ChIP結果顯示，結合AR以及H3K79me2的MYC顯著上升/降低。

 

4. 使用EPZ處理後，MYC Enhancer上的DOT1L、AR結合及H3K79me2甲基化均消失。

 

5. 細胞挽救實驗證明EPZ處理後迴轉AR，能回復MYC Enhancer上AR、DOT1L、H3K79me2的結合，也包括H3K4me2、H3K27AC等。

 

6. EPZ處理後過表達AR，MYC mRNA表達水平回復，LNCaP細胞對EPZ的耐藥性增強。

 

7. 用CRISPR/Cas9技術敲除MYC上AR結合的DNA區域，僅LNCaP細胞中細胞增殖受到抑制，MYC mRNA表達下降。