複雜的大腦是如何從簡單的電路進化而來的？在這裡，作者研究了小腦核(小腦的輸出結構)在細胞類型解析度下的腦區進化。利用小鼠、雞和人的單核RNA測序，以及STARmap空間轉錄分析和全中樞神經系統投影追蹤，作者鑑定了一個保守的細胞類型集合，包含兩個區域特異性興奮神經元類別和三個區域不變抑制神經元類別。這一組構成了一個原型小腦核，它被重複複製以形成新的區域。在大量擴張的人類外側核中，優先將信息輸送到小鼠外側額葉皮質的興奮性細胞類佔主導地位。這項研究展示出一個通過整個細胞類型集合的複製和分化而形成的大腦區域進化模型。
8-12周大的雄性C57BL/6J小鼠；成年(~20周齡)公雞作為家禽疾病與腫瘤學實驗室(ADOL)6×7系雜交的F1後代；死於癌症的患者：捐贈者H1和捐贈者H3是65歲的白人男性，捐贈者H2是一名39歲的黑人女性
雖然大多數細胞只有一個核，但滋養層細胞、破骨細胞和骨骼肌纖維等細胞類型需要多核。多核的一個優點是可以將不同的功能分配給不同的細胞核，但由於存在共同的細胞質，對多核組織內轉錄異質性的全面詢問一直是具有挑戰性的。在這裡，作者利用單核RNA測序(snRNA-seq)來確定多核骨骼肌纖維內轉錄多樣性的程度。來自小鼠骨骼肌的細胞核在整個生命周期中被描繪出來，這表明在出生後發育和衰老的肌肉中出現了不同的肌核群體。作者的數據集還為發現與肌肉細胞罕見的特殊區域相關的基因提供了一個平臺，包括肌腱連接的標記和在神經肌肉連接表達的功能驗證因子。這些發現表明，合體肌纖維內的肌核具有調節肌肉生物學的不同轉錄特徵。
選取出生後第10天、第21天、5月齡、24月齡和30月齡，安樂死後立即分離小鼠脛骨前肌或比目魚肌進行提核單分子RNA螢光原位雜交，qRT-PCR 圖1 部分結果展示右圖：對出生後第10天、第21天、5月齡、24月齡和30月齡脛骨前肌的snRNA-seq數據進行UMAP綜合分析。文章三：CoolMPS用於液滴法捕獲的單核RNA的穩健測序大規模平行單細胞和單核RNA測序(scRNA-seq，snRNA-seq)需要大量的測序，以實現每個細胞的適當覆蓋，這使得測序資源和測序器的可用性成為進行深度轉錄圖譜的關鍵因素。CoolMPS是一種新的合成測序方法，它依賴於可重複使用的抗體進行核苷酸標記，但它是否適用於snRNA-seq還沒有得到測試。在這裡，作者使用一種低成本的現成協議將廣泛使用的Chromium 10X技術生成的庫進行化學轉換，使其可以使用CoolMPS技術進行排序。為了評估用CoolMPS測序的轉換文庫的質量和性能，作者從年輕和老年小鼠的海馬中生成了一個snRNA-seq數據集。文庫在Illumina Novaseq上測序，轉換為與CoolMPS兼容的文庫在DNBSEQ-400RS上測序。CoolMPS衍生數據忠實地複製了原生文庫數據集的關鍵特徵，包括環境RNA汙染的正確估計、捕獲細胞的檢測、細胞群集結果、空間標記基因表達、複製間和複製內差異以及老化過程中基因表達的變化。總之，作者的結果表明，CoolMPS為基於液滴的文庫中RNA的標準測序提供了一種可行的替代方法。
老年C57BL/6J雄性野生型小鼠(18月齡)和青年C57BL/6J小鼠(3月齡)，從整個海馬體中分離出細胞核圖A：實驗流程，從兩隻幼齡(3月齡)和兩隻老齡(18月齡)小鼠的海馬區構建了4個10X的snRNA-seq文庫。分別使用Illumina Novaseq和DNBSEQ-400RS進行測序。圖G和H：UMAP圖，圖中代表了在(G)原生庫數據集中和(H)轉換庫數據集中分別帶細胞類型注釋的細胞文章四：利用單核RNA-seq驗證特發性肺纖維化中MUC5B相關的變異體 The MUC5B-associated variant, rs35705950, resides within an enhancer subject to lineage- and disease-dependent epigenetic remodelingdoi: 10.1172/jci.insight.144294rs35705950是位於MUC5B起始點上遊約3kb的G/T顛倒事件形成的變異體，它是特發性肺纖維化(IPF)的主要危險因素。在這裡，作者研究了這個MUC5B-3kb區域的功能和染色質結構，並提供了證據表明它作為經典定義的增強子受到表觀遺傳編程的影響。作者用新轉錄本分析結果表明RNA聚合酶II發生在G/T顛換位點的10bp內，形成了該區域的增強子功能。通過ATAC-seq分析新鮮和培養的人氣道上皮細胞的染色質可及性數據，證明該區域位於可及性染色質中，影響MUC5B的表達。利用成對的單核RNA-seq和單核ATAC-seq應用於IPF肺的冰凍組織，作者將這些發現直接擴展到疾病，結果表明IPF中MUC5B-3kb增強子的表觀遺傳編程，在表達MUC5B和不表達MUC5B的細胞系中都存在。綜上所述，該研究結果表明，MUC5B相關的變異體體rs35705950存在於一個增強子中，該增強子容易發生表觀重塑，並導致IPF的病理性錯誤表達。
用於單核分析的肺組織來自因多種適應症(結節、結構畸形、反覆感染)接受活組織檢查的患者snATAC-seq ，PRO-seq，ATAC-seqChIP-qPCR，qRT-PCR， MNase-qPCRsnRNA-seq和snATAC-seq數據的UMAP聚類圖
圖A：IPF患者和對照組的肺組織snRNA-seq數據的UMAP聚類圖圖B：利用來自成對snRNA-seq的基因表達信息，IPF和對照組肺的snATAC-seq數據的UMAP聚類圖 (A)MUC5B-3kb增強子的鹼基定位核小體包裝。(B)在多效性刺激下，發生染色質重塑，啟動增強子DNA與轉錄因子的相互作用。(C)在纖維化肺疾病的背景下，增強子被一系列轉錄因子激活，這些轉錄因子通過STAT、ETS和Forkhead box家族成員的半退化結合位點作用，導致RNAPII的招募和誘導MUC5B的表達。(D)MUC5B的表達反過來促進內質網應激和粘液纖毛功能障礙，導致相鄰細胞中MUC5B的額外激活，從而構成一個正反饋電路。文章五：單核轉錄組學揭示合體骨骼肌細胞的功能區劃分合體骨骼肌細胞在同一細胞質中含有數百個細胞核。作者利用從肌肉纖維中分離出的細胞核進行單核RNA測序(snRNAseq)，研究了未損傷和再生肌肉中的核異質性和轉錄動力學。這揭示了與纖維類型多樣性無關的不同的核亞型，和以前未知的亞型以及在神經肌肉和肌腱連接處預測的亞型。在Mdx營養不良小鼠模型的纖維中，也出現了不同的亞型：發現表達修覆信號的細胞核也在營養不良患者的肌肉中大量存在，還有與壞死纖維相關的核群體。最後，作者對手術方法的改進揭示了罕見的、特化的肌梭的區域化。研究數據確定了肌纖維的核區，並為其功能分析定義了一個分子路線圖；這些數據可以在MyoExplorer伺服器(https://shiny.mdc-berlin.de/MyoExplorer/)上自由瀏覽。
對於未受傷的、再生的脛前肌(分別為7和14天)和Mdx肌肉，分別從兩隻小鼠中匯總了兩塊TA（脛前肌）肌肉(每隻小鼠一塊TA)顏色表示未損傷或再生肌肉中不同的核群(左)或核（右）文章六：間歇性缺氧下小鼠內臟脂肪在單細胞水平的轉錄組變化 Transcriptomic Changes of Murine Visceral Fat Exposed to Intermittent Hypoxia at Single Cell Resolutiondoi: 10.3390/ijms22010261.間歇性低氧(IH)是阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)的特徵，可導致內臟白色脂肪組織(vWAT)出現炎症、脂解增加和胰島素抵抗等代謝功能障礙。然而，這些功能紊亂背後的細胞類型及其相應的轉錄途徑尚不清楚。在這裡，作者應用單核RNA測序(snRNA-seq)和RNA-seq相結合的方法來評估模擬阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣症候群(IH)暴露後vWAT中細胞的異質性。C57BL/6雄性小鼠暴露於IH和室內空氣(RA)中6周後，分離vWAT細胞核，進行snRNA-seq分析、細胞類型差異表達基因(DEGs)分析以及有意義的基因通路富集注釋。與RA相比，在vWAT中鑑定的14種不同細胞類型中，IH誘導了顯著的轉錄變化。作者確定了vWAT中的細胞特異性標誌物、轉錄網絡、代謝信號通路和細胞亞群富集。在全基因組範圍內，作者還在多種細胞類型中識別了298個與代謝途徑相關的共同調控基因。使用RNA-seq對vWAT中的細胞類型進行去卷積顯示，不同的脂肪細胞似乎在代謝功能障礙的關鍵方面存在差異。因此，vWAT的異質性及其在細胞水平對IH的反應為了解阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣症候群(OSA)的代謝性發病率提供了重要的見解，並可能轉化為治療靶點。
非肥胖C57BL/6雄性小鼠, 暴露於IH和室內空氣(RA)中6周後，分離vWAT細胞核，進行snRNA-seq分析圖1.小鼠外周脂肪組織(vWAT)的單核轉錄分析(snRNA-seq)
圖A：snRNA-seq和批量RNA-seq實驗設計圖E：RA和IH中每種細胞類型的top5的基因熱圖文章七：附睪脂肪組織在單核分解時對飲食誘導的肥胖反應的可塑性Plasticity of Epididymal Adipose Tissue in Response to Diet-Induced Obesity at Single-Nucleus Resolutiondoi: 10.1016/j.cmet.2020.12.004.脂肪組織表現出顯著的適應飲食狀態的能力。在這裡，作者應用單核RNA-seq技術在單核解析度下定位小鼠附睪白色脂肪組織的可塑性，以響應高脂飲食誘導的肥胖。單核方法使作者能夠檢測所有主要的細胞類型，並揭示從前脂肪細胞承諾到成熟脂肪細胞的整個成脂軌跡上不同的轉錄階段。作者證明了不同脂肪細胞亞群的存在，並表明肥胖會導致生脂亞群的消失和應激清除脂質亞群豐度的增加。此外，肥胖與其他細胞群體的豐度和基因表達的重大變化有關，包括巨噬細胞中脂質處理基因的急劇增加，而巨噬細胞特異性基因的犧牲。這些數據為未來以假說為導向的脂肪細胞分化和脂肪組織可塑性機制的研究提供了有力的資源。雄性C57BL/6JBomTac小鼠：10周齡小鼠餵飼高脂飲食(以誘導肥胖發展，而對照組給予低脂飲食18周(實驗1和2)或22周(實驗3)。對於實驗1和2，來自三隻小鼠的eWAT被混在一起進行核分離和snRNA-seq實驗；對於實驗3，使用一隻小鼠的eWAT進行細胞核分離和snRNA-seq實驗圖H：瘦小和肥胖小鼠的eWAT細胞類型的UMAP聚類圖綜上所述單細胞核技術已經被越來越多科研工作者所關注，也陸續發表一些研究成果，這些研究廣泛應用於多個物種（人、小鼠、大鼠、雞），多種樣本類型（腦組織、骨骼肌、海馬組織、肺臟組織、脂肪、睪丸等），並且適用冷凍組織，解決了單細胞轉錄組測序的局限。相信以上分享可以給老師帶來單細胞核轉錄組技術領域研究一些啟示，如果您對單細胞核轉錄組技術感興趣，那就快快與我們取得聯繫，百邁客助您高速跨入2021單細胞核轉錄組技術體驗！百邁客是國內首批引進10xGenomics單細胞測序平臺，使用Chromium系統採用先進的微流控、油滴包裹和barcode標記等技術實現一次性分離、高效標記捕獲；同時具有10x 單細胞轉錄組、單細胞核轉錄組、單細胞ATAC-seq、單細胞免疫組庫、全長轉錄組測序、空間轉錄組，實現10x平臺全面優質服務；已經具有大量單細胞分離捕獲，極低量RNA反轉錄擴增建庫成功經驗；提供單細胞分離捕獲、反轉錄建庫、測序、標準分析和高級分析全套單細胞測序服務；強大的生信團隊不僅提供基本分析，還提供細胞分化軌跡分析等多種高級分析；資深單細胞技術人員為您提供專業的課題方案設計，為您量身訂造專屬個性化分析。百邁客醫學科研服務事業部，是您值得信任和託付的團隊，我們將竭誠為您服務，期待與各位老師在今後的日子攜手合作，相信百邁客出品，必是精品。
文：Tanbn&Anna
排版：市場部