單細胞轉錄組+蛋白組+bulk RNAseq！多組學繪製全面肺衰老圖譜

文章信息

文章：An atlas of the aging lung mapped by single cell transcriptomics and deep tissue proteomics

期刊：Nature Communications

組學技術：scRNA-seq、mass spectrometry-based proteomics、bulk RNA-seq

材料：scRNA-seq：3月齡小鼠（n=8）和24月齡小鼠（n=7）；

mass spectrometry-based proteomics：3月齡小鼠（n=4）和24月齡小鼠（n=4）；

bulk RNAseq：3月齡小鼠（n=3）和22月齡小鼠（n=3）

研究背景

衰老會導致肺功能下降，也是全球第三大死亡原因——慢性肺病發展的主要危險因素。本文作者使用單細胞轉錄組學和基於蛋白質組學的質譜分析（mass spectrometry-based proteomics）來量化年輕和年老小鼠肺部30種細胞類型的細胞活性狀態變化。作者發現，衰老會導致轉錄噪聲增加，並且放鬆對表觀遺傳的控制。作者還觀察了衰老對於細胞類型特異性的影響，發現2型肺細胞和脂肪成纖維細胞膽固醇合成的增加，以及呼吸道上皮細胞的改變，是肺部老化的幾大標誌。本文通過蛋白組與單細胞轉錄組的整合分析預測了調節性蛋白的細胞來源，構建了一個無偏倚的肺衰老圖譜。

研究結果

1、肺衰老圖譜揭示轉錄調控的下調

作者取了15隻小鼠一共捕獲到14813個細胞（圖1a，年輕小鼠8隻，共7672個細胞；老年小鼠7隻，共7141個細胞）。通過使用高變基因對所有細胞進行無監督聚類，最終分成36個細胞群分別對應30種細胞類型，包括所有已知的上皮細胞、間充質細胞和白細胞系（圖1b,c）。

圖1 | 單細胞圖譜揭示小鼠肺部主要細胞類型

據報導，衰老是轉錄不穩定性增加的結果，而非轉錄協同產生的，並且與衰老相關的轉錄噪聲增加可能會導致不明確的細胞類型出現。因此，作者對轉錄噪聲做了量化分析，主要方法是計算每組年齡內每個細胞和細胞類型之間的歐式距離，該歐氏距離用作每個細胞轉錄噪聲的一種度量。結果發現，隨著年齡的增長，大多數細胞類型的轉錄噪聲增加（圖2a）。為了進一步排除技術混淆，作者將每隻小鼠樣本得到的歐氏距離取平均值，獲得了高度一致的結果（圖2b）。這項分析證實了轉錄噪聲會隨著年齡的增長而增加（圖2c，d），這與之前關於人類胰腺或小鼠CD4+T細胞的報導一致。

圖2 | 隨著年齡增長大多數細胞類型的轉錄噪聲增加

2、mRNA和蛋白的數據整合

為了驗證單細胞RNA測序（scRNA-seq）數據的完整性，以及肺部mRNA和蛋白含量隨年齡的變化，作者又分別取了6個（每組3個重複）和8個（每組4個重複）年輕和年老小鼠進行bulk RNA測序和蛋白質組質譜分析（圖3a）。作者利用scRNA-seq數據，將每個小鼠所有細胞的表達量求和模擬出一份bulk RNA數據，通過相關性分析觀察到真實bulk RNA數據和模擬數據之間存在很好的一致性，從而排除了單細胞解離過程可能帶來的幹擾影響（圖3b）。此外，作者還觀察到三組數據集在年齡變化上的強烈相關性（圖3c）。

無論在轉錄還是蛋白水平，上遊調節基因表達量變化表現都非常相近（圖3d）。在轉錄和蛋白兩組數據中，作者發現了一個促炎症特徵，包括Il6、Il1b、Tnf和Ifng上調，以及Pparg和Il10下調（圖3d）。受年齡調節的大多數基因集在轉錄組和蛋白質組中都顯示出相同的富集調控方向，且富集得分的pearson相關性係數顯著（圖3e）。許多細胞外基質基因，如Ⅲ型膠原，在mRNA和蛋白質水平均下調，所有基底膜相關的Ⅳ型膠原基因在蛋白水平均升高，但在轉錄水平（圖3f）和RNA原位雜交（圖3g）中的表達水平均降低。IV型膠原在轉錄和蛋白水平的差異突出了mRNA和蛋白結合分析的重要性。作者用免疫螢光法驗證了IV型膠原蛋白豐度的增加，有趣的是，老年小鼠的IV型膠原主要在呼吸道和血管周圍增加（圖3g）。

圖3 | 多組學數據整合揭示了RNA和蛋白質的調控關係

3、衰老會改變呼吸道上皮細胞和細胞外基質

作者分析了30種細胞類型組成隨年齡的變化，利用多維標度法（isoMDS() R function）對各細胞類型計數進行降維後，發現第一維度和年齡存在顯著關聯（圖4a，b；Wilcoxon檢驗，p<0.005），表明年輕和年老小鼠之間細胞類型組成不同。結果發現，與年輕小鼠相比，老年小鼠中纖毛細胞相對增多（圖4c，d），老年小鼠的各種免疫細胞群也顯著增加，包括CD4+和CD8+T細胞、嗜酸性粒細胞和經典單核細胞（圖4e），且纖毛細胞的標記基因呈顯著上調（圖4f）。作者使用Foxj1（纖毛細胞標記物）和CC10（纖毛細胞標記物）進行免疫染色驗證了這一發現（圖4g）。在這項分析中，老年小鼠的纖毛細胞增多（圖4h），導致了老年小鼠呼吸道中棒狀細胞和纖毛細胞比例發生了顯著改變（圖4i）。

圖4 | 細胞類型分析揭示老年小鼠呼吸道纖毛細胞的增加

作者在5138個蛋白中鑑定得到32個在老化過程中有顯著變化的基質蛋白（圖5a）。發現在老年小鼠中膠原XIV下調（圖5b），利用scRNA-seq數據將膠原XIV的表達定位到了間質成纖維細胞，這些成纖維細胞和間皮細胞也同時表達Decorin（圖5c）。以上結果表明，蛋白質組學與單細胞轉錄組學的結合能夠使我們預測調控蛋白的細胞來源。

作者應用先前開發的QDSP方法比較年輕和年老小鼠之間的蛋白質溶解度分布（圖6a）。通過對432種分泌型胞外蛋白的主成分分析，發現蛋白溶解度在第1主成分中分離，而年齡在第4主成分中分離（圖6b），分析還表明，許多ECM蛋白的豐度和溶解度，包括I型膠原和基底膜層粘連蛋白，均沒有發生改變，但是與基底膜相關的Fras1、Frem1，Frem2等在老年小鼠中均有下調（圖6c-i）。

圖5 | 通過單細胞轉錄組預測調控蛋白的細胞起源

圖6 | QDSP方法揭示細胞外基質（ECM）結構的變化

4、衰老對細胞類型的影響

通過對年輕和年老組間差異表達篩選出391個差異顯著基因（Wilcoxon秩和檢驗，FDR<10%）（圖7a），肺泡巨噬細胞和2型肺泡細胞是細胞數量最多的兩種細胞類型，這兩種細胞類型都在老年小鼠中表現出了明顯變化（圖7b-c）。作者觀察到MHCⅠ類基因H2-K1、H2-Q7、H2-D1和B2m基因顯著上調（圖7c），並用流式進行了驗證（圖7k-l）。作者利用肺泡巨噬細胞和2型肺細胞的單細胞轉錄組數據進行了PCA主成分分析和細胞類型注釋（圖7d-e），發現流式分選後的bulk RNA-seq與scRNA-seq結果呈現高度一致（圖7f-j）。

圖7 | 單細胞轉錄組測序中細胞類型差異分析

5、衰老細胞中膽固醇的合成增加

基於25個SREBP/Insig1已知靶點的上遊調控網絡分析發現，所有靶點均在衰老的2型肺泡壁細胞中增加（圖8a）。通過Uniprot、GO、KEGG注釋富集分析，作者發現膽固醇合成增加在2型肺泡壁細胞和脂肪成纖維細胞中非常顯著，沒有涉及到其他細胞類型（圖8b），大多數Insig1/2靶基因直接參與膽固醇的生物合成過程（圖8c）。為了確認膽固醇合成的增加並分析細胞的實際脂質含量，作者進行了免疫螢光檢測發現老年肺部脂質體染色增加在肺泡2型細胞存在特異性（圖8d）。此外，作者通過流式細胞術和尼羅紅染色發現，老年小鼠CD45-細胞的平均螢光強度顯著增加（圖8e-g），CD45+細胞無明顯改變，表明中性脂質含量增加是上皮細胞和成纖維細胞所特有。至此，作者已經證明2型肺泡壁細胞和脂肪成纖維細胞膽固醇合成和中性脂質含量的增加是肺衰老的標誌。

圖8 | 衰老小鼠中2型肺泡壁細胞和脂肪成纖維細胞中的膽固醇合成增加

總結

作者使用單細胞轉錄組和蛋白質譜分析量化了30種細胞類型的細胞活性狀態變化，通過整合分析，很好地預測了調節性蛋白的細胞來源，創建了肺衰老細胞參考圖譜。

本文揭示了肺部老化的幾大標誌：2型肺泡壁細胞和脂肪成纖維細胞膽固醇合成的增加，以及呼吸道上皮細胞的改變。

參考文獻

Angelidis I, Simon L M, Fernandez I E, et al. An atlas of the aging lung mapped by single cell transcriptomics and deep tissue proteomics[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1-17.

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