Nature背靠背 | 揭示衰老的秘密（二）多組學數據揭秘時間去哪了

前言

大家還記得上篇「揭示衰老的秘密（一）——小鼠衰老組織的單細胞圖譜的文章嗎？[1]

2020年7月15日，兩篇有關研究小鼠衰老圖譜的背靠背文章，發表於Nature。本次給大家介紹另外一篇文章。

英文標題：Ageing hallmarks exhibit organ-specific temporal signatures[2]

中文標題：衰老性狀表現出器官特異性的時間特徵

材料：10個年齡段的小鼠，17個組織

影響因子：42.78

發表期刊：Nature

主要運用的技術：bulk RNA測序、蛋白質組、FACS、smart-seq2

儘管衰老損傷的主要類型（如細胞間通訊的改變、蛋白質穩定的喪失和線粒體功能的破壞）已經被確定，但對這些有害過程與異常複雜器官內部和器官之間的相互作用以及全面的衰老動力學整個機體的分析仍較為缺乏。

本文對17個器官進行了bulk RNA測序，並對10個年齡階段的肌肉小鼠進行了血漿蛋白組學研究，將這些發現同 Tabula Muris Senis 細胞圖譜（即小鼠衰老圖譜「Mouse Ageing Cell Atlas」，2020年7月15日發表於Nature期刊）以及同最初的 Tabula Muris 圖譜（2018年10月3日發表於Nature期刊）整合，揭示了衰老過程中基因表達的線性和非線性變化。

主要結論

1、相關基因以一致的軌跡聚集，具有一致的生物學功能：包括細胞外基質調節、未摺疊蛋白結合、線粒體功能、炎症和免疫反應；

2、這些基因集在跨組織間表現出相似的表達，只是表達的波動以及表達開始的年齡不同；

3、免疫細胞的普遍激活尤為明顯，並首次在中年時期的白色脂肪組織中檢測到——單細胞RNA測序證實了脂肪組織中T細胞和B細胞（包括表達免疫球蛋白J的漿細胞）的積累，這些細胞也同時在不同器官中積累；

4、不同組織中的基因表達變化與血漿中相應的蛋白水平高度相關，從而潛在地促進了體循環的老化；

研究數據證明了器官間和器官內的衰老過程是相似但不同步的，為追蹤老年健康狀況下降的系統性來源提供了基礎。

樣本取材

為了揭示整個機體的衰老動態，文章研究了從C57BL/6JN小鼠中分離出來的17種器官類型的血漿蛋白和RNA序列。4隻雄性小鼠，年齡跨度1、3、6、9、12、15、18、21、24及27個月；相當於13歲、20歲、30歲、36歲、43歲、50歲、56歲、63歲、69歲和75歲的人類；2隻雌性小鼠，年齡跨度1、3、6、9、12、15、18及21個月（圖1a、b）。共涉及從1個月的發育到3-6個月的成熟，以及從成年到平均壽命27個月的老化。

圖1

從每個小鼠分離出17個器官，包括骨組織（股骨和脛骨）、大腦（hemibrain）、褐色脂肪組織（BAT，肩胛間的貯存脂肪）、性腺的脂肪組織（GAT，腹股溝貯存脂肪）、心臟、腎臟、下肢肌肉（脛骨前肌）、肝、肺、骨髓、腸繫膜脂肪組織（MAT）、胰腺、皮膚、小腸（十二指腸）、脾臟、皮下脂肪組織（SCAT、臀部貯存脂肪）和白細胞（白細胞層）。

與此同時，對小鼠的20個器官的529,823個細胞進行了單細胞RNA測序，生成了 Tabula Muris Senis 圖譜，並在相關文章中發表。

研究者也提供了數據的交互式展示網站：

https://twc-stanford.shinyapps.io/maca/

圖2

研究主要內容

1、不同年齡小鼠間差異基因比較

對不同年齡的小鼠，進行兩兩間差異基因比較。雖然在相鄰年齡的器官間觀察到一些差異，但在大多數器官中，差異的數量相對於3個月大的成年鼠而言，年老小鼠體內的DEGs顯著增加，表明只有在足夠的時間後才能檢測到基因表達的漸進變化（圖3d, e）。脾臟（spleen）是個例外，DEGs隨年齡逐漸減少，並且呈現出大量與細胞周期和血細胞發育相關的DEGs，甚至到中年。

值得注意的是，DEGs在中年小鼠的SCAT和GAT中增多（圖3d，圖8d）。這些可能與已知的脂肪成分隨年齡的變化有關，特別是與免疫細胞浸潤有關的器官，如腸繫膜脂肪和附在其上的小腸，只有在生命的晚期才會發生劇烈而明顯的基因表達變化。

圖3

為了獨立地證實上述觀察結果，研究者根據每個器官數據進行了SOM（self-organizing maps）分析（想了解什麼是SOM分析嗎？下次我們可以來篇專題介紹喲~~），實現相關基因節點的可視化。SOM分析結果中不僅出現了總體的衰老節點，而且白色脂肪組織表現出強烈的衰老特徵，其中內臟GAT和MAT的組織高度相似（圖4a）。

研究者觀察到性別在GAT、SCAT、肝和腎的顯著性影響可能與已知的脂肪儲存差異、性激素調節和腎血流動力學有關。這四種組織在人的一生中始終表現出最多的差異基因。並且差異在早期已經形成，在整個生命周期中保持。但構成這些性別差異基因的生物學途徑與構成衰老差異基因的生物學途徑有很大差異，因此沒有證據表明性別差異會影響文中所觀察到的轉錄老化情況（圖4b）。

圖4

幼年期的DEGs是否會隨著年齡的增長而持續？還是會隨著年齡的增長而被新的DEGs所取代呢？例如在骨中，隨著骨形成的完成，早期骨化基因表達減少，而這些基因與晚期表達增加的DEGs高度相關，代表了年齡相關的骨丟失。

總的來說，大多數器官顯示出早期和晚期DEGs之間的相關性，這一點幾乎可以從GAT、肝臟、腎臟和心臟的每一項成對比較中得到證明。很少有基因是特定於任何年齡的，器官特異性大於年齡特異性（圖5f）。

圖5

衰老器官間的差異表達特別有趣，因為無處不在的衰老途徑可能提供新的治療機會。當分離出器官間表達差異最頻繁的基因時，文章發現與免疫應答通路相關的基因高度富集（圖6g，圖7e-h）。

圖6

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圖7

值得注意的是 Jchain (也稱為 Igj ，即編碼血漿B細胞標記免疫球蛋白J的基因）的表達在整個生命周期中持續增加（圖8h-k）。

圖8

生物鐘基因 Bhlhe40、Bhlhe41、Arntl、Npas2、Per3、Ciart 和 Dbp 也在top DEGs中。與年齡相關的晝夜節律紊亂是眾所周知的，但這些數據可能凸顯了晝夜節律在整體健康狀況下降中的作用，未得到充分認識。事實上，紊亂的生物鐘被認為是導致新陳代謝和炎症紊亂，、並縮短人的壽命的原因[3]。

2、隨年齡變化的基因表達動態

兩兩間差異表達的比較是有限的，因此研究者進一步研究了在生命周期的基因表達動態變化，尋找在不同器官之間具有共同行為的整個生命周期的基因表達軌跡。通過計算所有17個器官中每個基因的平均軌跡，並將這些平均軌跡聚集在一起，揭示了衰老特徵的功能富集，如：炎症增加、線粒體功能障礙和蛋白穩定喪失（圖9a）。每個聚類包含具有相似軌跡的基因。但不同器官在軌跡上的相位和軌跡幅度不同，表明了類似的過程有不同的動力學。

文章用波幅指數（即1到30個月之間軌跡變化的z-score）以及變異性指數（平均軌跡分布的一種度量方法）來評估軌跡。具有最大波幅的cluster也顯示出最強的器官特異性。脂肪組織特異性在cluster4和cluster6，以及cluster7（蛋白摺疊）和cluster8（細胞外基質）非常突出。當對器官進行單獨分析時，尤其是GAT這樣的脂肪組織中，與免疫應答途徑相關的基因，在整個生命周期的表達增加尤其明顯。

圖9

儘管許多器官間共享下遊通路（圖9a），但轉錄因子調控網絡很少有重疊。雖然在組織之間出現了共同的生物途徑，但這些途徑並不由共同轉錄因子調控網絡的潛在變化所驅動。

3、RNA測序證實血漿B細胞浸潤

從整個器官的轉錄組學角度觀察到的基因表達變化，是由隨年齡增長的細胞內在變化驅動，還是由細胞組成的變化驅動的呢？

利用 Tabula Muris Senis 資料庫，首先研究基於bulk RNA中和年齡相關的top基因是特定於單個細胞類型還是廣泛表達於多種細胞類型。對於每個組織中的每個基因，根據在單細胞數據中表達該基因的細胞分布分配了一個離散評分（圖10a-c）。

圖10

例如，在腎臟中，附子酶基因Aco1 和 Aco2 以及檸檬酸合酶（Cs）與年齡呈負相關，並在多種細胞類型中表達（圖11a-f），顯示全器官線粒體功能下降。

圖11

其他基因如 Ms4a7 與年齡呈正相關，但僅在腎巨噬細胞中表達。這是許多其他特定於這些細胞的炎症基因上調的特徵（圖11b）。

除了離散度評分，對FACS結合smart-seq2以及droplet這兩個平臺的數據，也使用了deconvolution軟體對細胞特異性基因的表達譜進行了分析，以估計每個組織中細胞類型豐度的隨年齡的變化（圖12h）。

圖12

兩種方法都發現，相同的細胞類型隨著年齡的增長而豐度發生顯著變化，且效應值大於0.5，兩者的相關性是高度一致的。

在GAT和肝臟中，隨著年齡的增長，B細胞數量大量增加，進一步證明免疫細胞的積累是整個器官炎症信號的驅動者。

此外，四種方法(FACS scRNA-seq、droplet scRNA-seq、FACS bulk deconvolution和 droplet bulk deconvolution) 對細胞組分的描述具有較強的一致性，表明結果是高度穩定的（圖13g）。

圖13

4、血漿蛋白與器官mRNA的相關性

衰老是系統性的，一個器官的衰退可能刺激或加速全身功能障礙。在某種程度上，可能是由於介導細胞間和器官間通訊的血源因子發生了改變。

通過將血漿蛋白年齡軌跡與其在各器官中相應的基因表達軌跡相關聯，研究者試圖確定哪些器官促成了年齡相關的血漿蛋白質組的變化。

分析顯示，在35對特有的血漿蛋白/器官對中，25個血漿蛋白與基因表達至少在一個器官中是相關的（斯皮爾曼相關係數>0.6）（圖14a-b）。

圖14

研究者發現一些基因高度相關，如腎臟中的血管細胞黏附分子-1 (VCAM1)和脾臟中的成纖維細胞生長因子-10(FGF10)，以及其高度相關的因子，如大腦中的膠質纖維酸性蛋白(GFAP)。

值得注意的是VCAM1和periostin（POSTN），它們在多個器官之間都顯示出異常的相關性。

VCAM1最近被確認為老齡血漿所導致大腦衰老的關鍵介質，脂肪組織中POSTN的丟失導致脂質代謝受損。此外，兩者都與細胞外基質調節和纖維化疾病有關，可能提示年齡相關性纖維化。

Trobospontin-4（THBS4）隨年齡的增長而降低，並且在本研究中與肌肉中的基因表達高度相關，最近的研究表明它可以促進突觸的形成並在年輕血液中富集。

值得注意的是，在本分析中也出現了白色脂肪組織，在內臟MAT和GAT中有5個血漿蛋白與基因表達高度相關，在SCAT中有3個蛋白與基因表達高度相關（圖14a）。在具有少量DEGs的肢體肌肉中，有7種血漿蛋白與整個生命周期的基因表達相關，其中包括骨形態發生蛋白-1（BMP1），基質金屬蛋白酶-2（MMP2）和其他與細胞外基質相關的蛋白。這種細胞外基質相關蛋白在文中所鑑定的25種血漿蛋白中佔大多數（圖15b）。

圖15

血漿蛋白的豐度變化可能與基因表達的差異無關。例如，隨著年齡的增長，組織可能會優先釋放出更多的某些蛋白質。此外，一些組織與年齡相關性不高，但顯示出了編碼血漿蛋白基因的高表達。

未來的研究將確定這些基因表達的變化是否導致了血漿蛋白質組中與年齡相關的功能差異，或者它們是否介導了其他過程，如免疫細胞粘附和浸潤。

總結

文章數據集提供了小鼠整個生命周期中所有主要器官的轉錄組和血漿蛋白質組的時間解析度，可以作為跨多學科研究的基礎資源。研究者發現基因表達軌跡與之前鑑定的有害過程一致，如線粒體功能障礙、受損蛋白摺疊和炎症。此外，中年出現的DEGs與晚年出現的DEGs高度相關，表明這些有害過程在不同的器官中較早出現。

參考文獻

[1] Schaum N, Lehallier B, Hahn O, et al. Ageing hallmarks exhibit organ-specific temporal signatures[J]. Nature, 2020, 583(7817): 596-602.

[2] Almanzar N , Antony J , Baghel AS , et al. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse[J]. Nature, 2020, 583(7817):1-6.

[3] Hood S, Amir S. The aging clock: circadian rhythms and later life. J. Clin. Invest. 2017,127: 437–446.

END