Nature背靠背 | 揭示衰老秘密（一） ：小鼠衰老組織的單細胞圖譜

前言

2020年7月15日，兩篇有關研究小鼠衰老圖譜的背靠背文章，發表於Nature。今天為大家揭曉其中一篇的面紗。

2018年10月，The Tabula Muris Consortium牽頭建立了一個小鼠20個器官單細胞轉錄圖譜 Tabula Muris ，文章發表於Nature期刊[1]，是本文中介紹的小鼠衰老組織單細胞圖譜 Tabula Muris Senis 的前身。

那麼本篇小鼠衰老組織單細胞圖譜又是如何來為我們解開衰老的秘密呢？一起來看看吧！

基本信息

英文標題：A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse[1]

中文標題：小鼠衰老組織的單細胞圖譜

材料：6個不同年齡段，共23個組織和器官的小鼠

影響因子：42.78

發表期刊：Nature

主要運用的技術：FACS、10x Genomics

衰老的特徵是逐漸喪失生理完整性，導致功能受損，增加死亡的可能性。為了更好地了解衰老過程，作者生成了一個橫跨小鼠生命周期的單細胞轉錄組圖譜，包括23個組織和器官的數據。

研究結果表明多種細胞類型和器官都發生了細胞特異性變化，不同器官的細胞組成也發生了與年齡相關的變化。利用單細胞轉錄組數據，研究者評估了不同年齡特徵的細胞類型特異性表現，如衰老、基因組不穩定性和免疫系統的變化。

本研究的轉錄組圖譜，稱之為 Tabula Muris Senis 或「小鼠衰老細胞圖譜」，揭示了如何在廣泛的組織和細胞類型的分子信息中反映衰老最重要的特徵。

樣本設計

對來自6個年齡組的雄性和雌性C57BL/6JN小鼠的35萬多個細胞進行了單細胞RNA測序，從1個月大（相當於人類早期兒童）到30個月大（相當於人類百歲老人），涉及小鼠膀胱、骨髓和大腦的單細胞懸液（小腦、皮質、海馬和紋狀體）、脂肪（棕色、性腺、腸繫膜和皮下）、心臟和主動脈、腎臟、大腸、四肢肌肉和膈肌、肝臟、肺、乳腺、胰腺、皮膚、脾臟、胸腺、舌頭和氣管（圖1a）。

圖1

研究內容及結論

1、被標註為B細胞或內皮細胞的細胞往往佔據相同的cluster，而與它們的組織來源或處理方法無關

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對同一隻老鼠的多個器官的分析，能夠獲得受年齡、環境和表觀遺傳影響控制的數據。

2018年已經發表並構建的 Tabula Muris 圖譜[2]，包含來自3個月時間點的數據，代表了大約整個數據集中20%的細胞，是本次數據（增加的時間點）semi-automated細胞類型注釋的基礎。使用這種方法（圖1b），能夠自動注釋多至70%的細胞。

使用bbknn batch-alignment algorithm進行批次矯正，之後用graph-based的聚類方法，並評估同一cluster中相同注釋細胞的共現情況。

被標註為B細胞或內皮細胞的細胞往往佔據相同的cluster，而與它們的來源組織或處理方法無關（圖2）。

圖2

2、基因表達變化與細胞群體中細胞數量變化，以及每個細胞中基因表達水平變化相關

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通過對組織的 Tabula Muris Senis 和bulk RNA sequencing數據中基因表達變化的分析，研究人員觀察到，在許多情況下，基因表達的變化是和群體中細胞數量的變化以及每個細胞中基因表達水平的變化相關（圖3）。

圖3

文章研究了表達 Cdkn2a 的細胞片段隨年齡的變化。Cdkn2a 及其蛋白產物p16的表達是最常用的衰老標記之一，也是衰老的一個重要標誌。根據FACS及droplet結果，年老小鼠中表達 Cdkn2a 的細胞比例比年輕小鼠高出一倍以上（圖4 a,b）。隨之而來的是 p16在其表達細胞中的表達水平兩倍的增長（圖4 c,d）。

圖4

值得注意的是，在30個月大的小鼠中，表達p16的細胞比例比24個月大的小鼠要小，這可能是因為長壽的動物衰老速度較慢。Cdkn2a 在衰老和其表達的細胞比例之間具有最高的相關性。其他正相關基因也包括 E2f2、Lmnb1、Tnf、Itgax。對於一些基因，包括Sirt家族成員（Sirt3, Sirt4 和Sirt5 ），其表達的細胞比例隨著年齡的增長而減少。這與之前文獻中發現的sirtuin（Sirt家族基因的蛋白質產物）對延緩細胞衰老至關重要的發現相一致。

3、每種組織類型的細胞組成往往隨年齡而變化

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對於至少有三個時間點數據的組織，文章研究了這些組織中細胞組成的變化：

圖5

（1）隨著年齡的增長，膀胱細胞（bladder）類型的組成出現了明顯的變化（圖5e）：在小鼠生命周期中，膀胱間葉組織（the mesenchymal compartment）細胞類型減少了三倍（圖5e，左），而尿路上皮細胞類型增加了相似的數量（圖5e，右）。

利用差異基因表達分析來評估組織隨年齡的整體變化，發現基質相關基因（Col1a1、Col1a2、Col3a1 和 Dcn）下調，而上皮相關基因（Krt15、Krt18 和 Sfn）上調。

內皮細胞數量的下降表明，小鼠膀胱老化可能與較低的器官血管硬化有關，這與最近的發現[3][4]及觀察到的血管相關基因 Htra 及 Fos 的下調是一致的。

白細胞數量的增加可能表明炎症組織微環境，與文獻報導的膀胱過度活躍內容一致，是衰老的共同特徵[5]，Lgals3、Igfbp2 和 Ly6d 在組織中顯著過表達支持了這一點，同時與免疫反應相關的基因，如 Tnfrsf12a 和 cdkn1a，在膀胱（間質）細胞和膀胱尿路上皮細胞中過表達。

此外，在比較不同年齡時，觀察到老齡白細胞中促炎標誌物（如 Cd14、Lgals3 和 tnfrsf12a）表達增加，抗炎標誌物（如 Cd9 和 Cd81）表達減少。

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（2）年齡相關的腎臟（kidney）變化包括繫膜細胞、毛細血管內皮細胞、上升支上皮細胞和厚上升支上皮細胞的相對豐度減少。繫膜細胞和毛細血管內皮細胞都是腎小球的核心細胞，它們的相對豐度隨著年齡的增長而減少（圖5g，上），同時組織範圍內 Egf 和 Atp1a1 表達減少（圖5h），提示腎小球濾過率受損。

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（3）在脾臟（spleen）中，T細胞的比例隨著年齡的增長而減少，而漿細胞的相對數量則增加（圖5i）。B細胞和漿細胞marker基因的上調支持了這一點（Cd79a 和 Jchain（也稱為 Igj ）。圖5j)。同樣，在乳腺中，我們觀察到T細胞數量下降。

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（4）肝臟（liver）的組織結構也隨著年齡的增長而變化。研究者觀察到與年齡相關的肝細胞相對數量減少，白蛋白表達的減少支持了這一觀點。

4、在所有的器官中，與年齡相關的突變數量增加

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基因組不穩定性是研究最為廣泛的衰老特徵之一。full-length轉錄本數據可以研究隨著年齡積累的體細胞突變。研究人員通過觀察特定組織中，在每個年齡組至少覆蓋75%的細胞的表達基因，發現這些組織中與年齡相關的突變數量增加（舌頭和膀胱是最受影響的）。

圖6

5、通過分析整個機體B細胞和T細胞之間的克隆關係，證實衰老也會影響免疫系統

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衰老也會影響免疫系統，所以研究者也分析了整個機體B細胞和T細胞之間的克隆關係。分別使用singlecell-ige和TraCeR對FACS數據中出現的B細胞和T細胞受體的序列進行了計算重建。分析了singlecell-ige輸出，根據組裝好的B/T細胞受體的序列來定義B/T細胞克隆型。

儘管大多數細胞在3個月時不是同一個克隆（9%屬於同一克隆family），但屬於同一個克隆型的B細胞數量在18個月時相比較於3個月增加了一倍（20%），同時從18個月到24個月也增加了一倍（增加至約38%)。在3個月、18個月和24個月的小鼠中，組裝T細胞受體的細胞數量大致相等（分別為2076、2056和1868個細胞）。3個月大的小鼠的T細胞中只有大約3%（1895個細胞中的55個）是克隆的一部分。在18個月和24個月時，這個值分別增加到約23%（2056個細胞中的479個細胞）和20%（1780個細胞中的348個細胞），再次表明T細胞免疫組庫的克隆性隨年齡的增加。

B細胞和T細胞克隆性的改變值得注意，因為它們表明24個月大的小鼠的免疫系統不太可能對新的病原體做出反應。也證實了文獻中的報導：與年輕人相比，老年人對新感染的脆弱性更高，接種疫苗的益處更低[6][7]。

最後，計算整體多樣性評分，以確定哪些細胞類型更容易隨年齡變化（圖7）。計算多樣性得分作為聚類分配的香農熵，然後對年齡進行回歸，得到一個P值， 觀察到來自大腦和腎臟的免疫系統細胞多樣性的顯著變化（圖8a，8b）。這些結果並沒有被每個細胞表達的基因數量所幹擾。

圖7

圖8

軌跡分析表明，「年輕的」小膠質細胞在獲得「年老的」小膠質細胞的特徵之前，會經歷一個中間狀態，即主要由18個月大的小膠質細胞組成的cluster所代表的狀態（圖9）。

在腦內的髓系小膠質細胞中，多數「年輕的」（3個月大）小膠質細胞佔據cluster1和cluster6，而「年老的」（18個月和24個月）的小膠質細胞構成cluster10，cluster12和cluster14中的絕大多數細胞（圖10）。

圖9

圖10

總結

小鼠衰老組織的單細胞圖譜 Tabula Muris Senis，為細胞生物學community提供了一個有關分子和細胞類型特異性的衰老「畫像」，提供了表型和生理學的深層特徵，並為理解哺乳動物在其生命周期中發生的細胞生物學變化提供了參考。

參考文獻

[1] Almanzar N , Antony J , Baghel AS, et al. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse[J]. Nature, 2020, 583(7817):1-6.

[2] The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature, 2018, 562:367–372.

[3] Burmeister DM, AbouShwareb T, Bergman CR, et al. Age-related alterations in regeneration of the urinary bladder after subtotal cystectomy. Am. J. Pathol., 2013, 183:1585–1595.

[4] Andersson KE, Boedtkjer DB, Forman A. The link between vascular dysfunction, bladder ischemia, and aging bladder dysfunction. Ther. Adv. Urol., 2017, 9:11–27.

[5] Suskind AM. The aging overactive bladder: a review of aging-related changes from the brain to the bladder. Curr. Bladder Dysfunct. Rep., 2017, 12:42–47.

[6] Goronzy JJ, Weyand CM. Understanding immunosenescence to improve responses to vaccines. Nat. Immunol., 2013, 14:428–436.

[7] Goronzy JJ, Weyand CM. Successful and maladaptive T cell aging. Immunity, 2017, 46: 364–378.

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