上一次說了蛋白質組學top-down的技術路線(從蛋白質層面進行分離)，點擊這裡查看。今天盛師傅繼續帶來top-down的兩篇文章，均選自各所在領域的頂級期刊。看一下頂級期刊的蛋白質組學文章怎麼寫。（在公眾號下回復180129可下載）
首先第一篇文章Proteomic analysis of synovial fluid from the osteoarthritic knee: comparison with transcriptome analyses of joint tissues，來自Arthritis Rheum，影響因子6.918,風溼類頂級期刊。
還記得酸菜說的文獻速讀法麼？直接速讀摘要和圖表來看看整篇文章做了什麼東西。
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Methods裡的第一句就是：Age-matched knee SF samples from 10 control subjects, 10 patients with early-stage OA, and 10 patients with late-stage OA were compared using 2-dimensional difference-in-gel electrophoresis and mass spectrometry (MS).
臨床樣本分組，用二維電泳(2D-DIGE)和質譜(MS)對SF中的蛋白質進行分離、鑑定和定量。
總共找出了66個顯著差異表達的蛋白。為了找出early OA 和late OA蛋白表達的特徵，作者做了聚類熱圖。發現大部分蛋白的表達一致，結果就是如Figure1所示。
接下來做什麼呢？看第二句：MS with a multiplexed peptide selected reaction monitoring assay was used to confirm differential expression of a subset of proteins in an independent OA patient cohort.
用SRM(選擇反應監測)對挑選出的差異蛋白用獨立的樣本進行驗證，也就是Figure.2的結果。這裡SRM是靶向蛋白質組學的一種方法，將會在以後專門介紹靶向蛋白質組學(MRM/RPM)和基於DIA的定量蛋白質組學。
然後看Methods裡的最後一句：Proteomic results were analyzed by Ingenuity Pathways Analysis and compared to published synovial tissue and cartilage messenger RNA profiles.
將挑選出來的差異蛋白進行IPA通路分析，最後把蛋白質組學和轉錄組學結合起來分析，但可能因為經費的問題，用了公共資料庫。將得到的差異表達蛋白與已發表公共資料庫中(GEO)的mRNA表達譜進行對比，重點關注RNA和蛋白表達的相關性，得到一系列表達趨勢一致的蛋白。
你看，光看一下摘要裡的方法部分以及Figure，整篇文章的脈絡就很清楚了，酸菜誠不欺我。
這篇還算容易，而且摘要是結構式的也好找。我們再來看難一點的第二篇文章Changes in regulation of human monocyte proteins in response to IgG from patients with antiphospholipid syndrome，來自Blood，影響因子11+的血液學標杆。
同樣的速讀摘要和圖要來看看整篇文章的大概思路和技術路線。
這個不是結構式摘要，所以要一句句看了，還好本文摘要簡單明了。第一句是研究背景，第二句開始就是研究方法了。
We carried out a comprehensive proteomic analysis of human monocytes treated with IgG from patients with different manifestations of the APS. Using 2-dimensional differential gel electro-phoresis (2D DiGE).
首先用二維電泳對用APS IgG的處理組和用HC IgG的對照組進行top-down差異蛋白質定量分析，得到了一系列蛋白，選出那些改變最大，差異最顯著的蛋白質點進行質譜鑑定，結果如下圖（Table2）。
簡單的闡述下結果後，接下來作者從不同的方面來驗證這些差異蛋白。
These findings were confirmed by comparing monocytes isolated from APS patients and HC.
之前進行2DE實驗，細胞是用混合的IgG來進行處理的（不混合的用2DE做的話會累死）。於是作者用每個患者單獨提取的IgG來對單核細胞進行處理，從mRNA和蛋白質層面進行驗證。
然後作者檢測每位患者體內的單核細胞經過LPS刺激後這幾種差異蛋白的mRNA表達情況和 Anti-VIM antibodies的表達情況。
再簡單的介紹下結果，最後作者用buttom-up（從多肽層面進行分離）中的label-free技術進行定量並用qPCR進行了驗證。
We further characterized the proteome of thrombotic APS IgG-treated monocytes using a label-free proteomics technique.
整篇文章就是用了二種技術（top-down和buttom-up)進行了蛋白質組學研究，並挑選出差異最顯著的蛋白並進行了不同層面的驗證。作者在討論中解釋了為什麼要用二種技術來進行。
Not all proteins, however, are amenable to 2D DiGE particularly hydrophobic membrane proteins. Therefore, to ensure that we had fully characterized the proteome,we studied tryptic digests of IgG-treated monocyte proteins using LC-MS/MS label-free quantitation on a Q-TOF mass spectrometer.
看起來好像有點道理，其實盛師傅認為作者不如用只用label-free來進行，但為了符合頂級期刊的身份，需要做的更深入(需要效果更好的預分級）。
隨著nanoLC的不斷發展和高解析度質譜的不斷成熟（比如兩款非常經典的質譜tripletof5600和q-orbitarp出現），buttom-up不管定量或定性效果比top-down好的多。另外，2DE做起來實在太麻煩。在下一期中，盛師傅將介紹性價比最高的buttom-up套路。
兩篇文章講完了，思路都是非常簡單，就4步：
1.臨床樣本分組；
2.分離、鑑定和定量 (第一篇2DE,第二篇2DE+label-free)；
3.差異蛋白進行生信分析 (第一篇IPA通路分析和與轉錄組對比)；
4.驗證 (第一篇SRM，第二篇qPCR+WB)。
是不是有一種我好像也能發頂級期刊的樣子，那還等什麼，趕快行動起來！