景傑生物|解讀
景傑編者按：質譜序技術可以對複雜樣品中蛋白質的濃度和共價修飾進行平行地測量。 最近，通過同時測定數千種蛋白質的熱變性曲線，質譜的這方面的應用已經擴展到探測蛋白質組的三維結構和構象狀態。雖然許多動物及其常駐微生物存在於相對狹窄，受調節的生理溫度範圍之內，但植物所處的環境經常會劇烈的溫度變化，這可能影響蛋白質熱穩定性的進化與演變。
威斯康星大學麥迪遜分校生物化學系的Michael R. Sussman教授在Molecular & Cellular Proteomics雜誌上發表文章，通過質譜首次深入研究了擬南芥的熱蛋白質組。 研究者通過使用六個生物學重複，分析了1700多個擬南芥蛋白的溶解曲線，觀察到蛋白質熱穩定性與許多已知蛋白質特徵之間的顯著相關性，包括蛋白分子量相關性和帶電胺基酸、極性胺基酸的比值相關性。研究者還發現了植物26S蛋白酶體核心和調節結構域的熱穩定性差異，這可能反映了溫度脅迫期間蛋白質轉換受調節方式的獨特性質。
關鍵詞：熱蛋白組，熱穩定性，蛋白質構象，擬南芥 ，串聯質譜
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研究速讀
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實驗思路：
研究者採用六組生物學重複，利用高通量蛋白組學分析結合質譜（Mass Cytometry）、生物信息學分析的方法在擬南芥中鑑定到4246個蛋白，利用熱蛋白組（Thermal Proteome Profiling）分析Tm經驗值與蛋白質熱穩定性各種可能的物理化學決定因素之間的相關性。
1. 熱蛋白組使用同位素編碼的基於質譜來同時分析上千種蛋白質。
將十份樣品置於溫度梯度上溫育，並將上清液進行十通道同量異位標記。 使用標準的基於MS / MS的定量來測量蛋白質水平相對豐度值。這個值適合於所描述的雙態模型。
Figure 1. 熱蛋白組的工作流程
2. 熱穩定性特徵
研究者檢測了每個定量蛋白的八種化學和結構特徵，來研究其與特穩定性的關係。這些特徵包括：分子量、蛋白豐度、脂肪指數、等電點、相對疏水性、帶電與極性殘留偏差（CvP）、預測的二級機構組成以及20種標準胺基酸的相對含量。所有這些特徵要麼通過計算，要麼通過胺基酸資料庫預測。在這些特種當中，分子量、疏水性、帶電與極性殘留偏差、alpha螺旋和beta片層的含量跟相對熱穩定性呈顯著相關性。
Figure 2 蛋白溶解溫度和潛在協變量的關係
3. 擬南芥的蛋白酶體
研究者在基因集富集分析中觀察到蛋白酶體亞基富集在最低和最高的bins。 因此，研究者仔細研究了每種蛋白酶體蛋白的Tm分布，發現核心和調節亞基之間的熱穩定性存在顯著差異。許多蛋白酶體亞基在擬南芥基因組中作為多個旁系同源物存在，並且本數據中模擬了大多數亞基的至少一個同源物。 所有建模的核心亞基在蛋白質組範圍的上端具有Tm值，而所有調節亞基Tm值都在較低的區域中。
Figure 3 26S蛋白酶體亞基的溶解溫度
4. Mg-ATP 處理後的熱穩定性變化
為了闡述熱蛋白組適用於Mg-ATP處理後植物蛋白的構象變化，研究者利用熱蛋白組分析了control 和Mg-ATP處理過的擬南芥裂解液，並用已有的蛋白功能注釋計算和比較了Tm值的變化。
Figure 4 Mg-ATP 處理後的熱穩定性變化
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小結
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本文採用了高通量蛋白組學分析結合質譜和生物信息學分析的方法，找出了高脂飲食組小鼠卵母細胞中的差異表達蛋白，鑑定出潛在關鍵效應因子。蛋白組學分析表明TIGAR蛋白在高脂飲食小鼠卵母細胞中顯著下調，並且TIGAR的表達可以降低高脂飲食小鼠卵母細胞中的氧化應激。本文通過Western blot的方法對組學數據做了鑑定，表明組學數據的正確性。另外，本文通過敲低和過表達TIGAR揭示了其在ROS調節、自噬過程中的作用。
研究者使用六個生物學重複質譜和生物信息學分析的方法在擬南芥中鑑定到4246個蛋白，首次研究了擬南芥的熱蛋白質組。利用熱蛋白組分析Tm經驗值與蛋白分子量相關性、胺基酸帶電與極性殘留偏差因素之間的相關性。研究者還發現了植物26S蛋白酶體核心和調節結構域的熱穩定性差異，這些發現跟之前的報導基本一致，但在某些方面具有顯著差異。這部分工作給研究者們打開了探尋蛋白-配體互作的新大門，為研究遺傳與環境因子對植物蛋白構象影響提供了更多可能。
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